Summary

Chirurgische Perfusion und Isolierung der Bauchspeicheldrüse des Schweins zur Inselisolierung

Published: June 07, 2024
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Summary

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entnahme einer Bauchspeicheldrüse des Schweins für die Isolierung und Reinigung von Inselzellen.

Abstract

Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine aufstrebende Behandlung von Typ-I-Diabetes. Sie ist jedoch durch die Zuordnung und Verfügbarkeit von Spendern begrenzt. Die Xenotransplantation von Schweineinseln bietet eine vielversprechende Alternative zur Allotransplantation mit dem Potenzial für die großtechnische Produktion von funktionellen Inselzellen auf Abruf. Die Ausbeute und Lebensfähigkeit isolierter Inselzellen hängt stark von der Qualität der Spender-Bauchspeicheldrüse und der Art der Gewinnung ab, insbesondere von der Dauer der Warm-Ischämie-Zeit. Um die Organkonservierung und die anschließende Ausbeute und Lebensfähigkeit der Inselzellen zu verbessern, haben wir ein Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins entwickelt. Dieses Protokoll verwendet eine direkte infrarenale Aortenkanüle und Organperfusion, um sowohl die Zeit der warmen Ischämie zu minimieren als auch das Verfahren für Bediener zu vereinfachen, die nicht über umfangreiche chirurgische Erfahrung verfügen. Durch die anschließende arterielle Perfusion der Bauchspeicheldrüse über die Aorta wird stagnierendes Blut aus den Mikrogefäßen gespült, wodurch Thrombosen und oxidative Schäden am Gewebe reduziert werden. Dieses Manuskript enthält ein detailliertes Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins, gefolgt von der Isolierung und Reinigung der Inselzellen.

Introduction

Typ-1-Diabetes wird durch die autoimmune Zerstörung von Betazellen der Bauchspeicheldrüse verursacht1. Folglich sind die Patienten auf exogenes Insulin angewiesen, was sie einem hohen Risiko für glykämische Schwankungen mit Episoden von Hyper- und Hypoglykämie aussetzt2. Die Insel-Allotransplantation ist ein potenzielles Heilmittel für Typ-I-Diabetes. Die begrenzte Verfügbarkeit von Organspendern für die Bauchspeicheldrüse ist jedoch nach wie vor ein großes Hindernis für die breite Einführung des Verfahrens 2,3. Die Insel-Xenotransplantation von Schweinespendern ist eine vielversprechende Alternative, da diese Tiere leicht verfügbar sind. Die Optimierung und Skalierung der Isolierung von Pankreasinseln von Schweinen wird für den Fortschritt der Insel-Xenotransplantation von entscheidender Bedeutung sein.

Obwohl bereits mehrere Techniken zur Entnahme der Bauchspeicheldrüse von Schweinen veröffentlicht wurden, beschreiben viele dieser Verfahren die Pankreeatomie nach Induktion des Herztodes oder der Exsanguination 4,5,6,7,8,9,10. Ein großer Nachteil dieser Techniken ist die variable warme ischämische Zeit (WIT), die zwischen dem Zeitpunkt des Herztodes und dem Beginn der intraarteriellen und/oder intraduktalen Infusion der Konservierungslösung auftritt. Bereits 10 Minuten WIT wirken sich negativ auf den Ertrag und die Rentabilität der Inselzellenaus 5. Die Minimierung der WIT erfordert eine sofortige Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit einer Konservierungslösung. Bei der Entnahme von Bauchorganen ist die Kanülierung der Aorta mit anschließender intrakorporaler Perfusion mit der Lösung der University of Wisconsin (UW) von entscheidender Bedeutung für die Blutentfernung, die Vorbeugung intravaskulärer Thrombosen, den Schutz vor ischämischen Schäden und die Minimierung von Zellschäden11,12.

Frühere Studien haben gezeigt, dass bei der Entnahme der Bauchspeicheldrüse des Schweins die Niederdruckspülung des Truncus coeliacus und der Arteria mesenterica superior mit UW-Lösung die Ausbeute und Reinheit der Inselzellen verbessert4. Zu den bisher veröffentlichten Methoden zur Entnahme der Bauchspeicheldrüse von Schweinen gehört jedoch die Kanülierung der offenen Aorta, die insbesondere bei kleineren Schweinen eine technische Herausforderung darstellen kann 13,14,15. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll mit begleitenden visuellen Hilfsmitteln für die chirurgische Perfusion und Entnahme der Bauchspeicheldrüse des Schweins vor, gefolgt von der Isolierung und Reinigung der Inselzellen. Diese neue Technik der Aortenkanülierung während der Pankreasisolierung wurde speziell entwickelt, um den WIT zu minimieren und die Pankreasbeschaffung in einem blutleeren Feld durchzuführen, um die Ausbeute und Lebensfähigkeit der Inselisolierung zu maximieren.

Protocol

Alle Verfahren mit Tieren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Washington University School of Medicine Division of Comparative Medicine genehmigt. Erwachsene Yorkshire-Schweine mit einem Gewicht von 35 bis 35 kg sind ideal für dieses Verfahren. Das Protokoll kann jedoch je nach Versuchskontext für Schweine unterschiedlicher Größe angepasst werden. Der gesamte Eingriff sollte steril in einem Operationssaal durchgeführt werden. <p class="jove_title"…

Representative Results

Der operative Aufbau und die Mittellinien-Laparotomie sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Laparotomieschnitt sollte gekrümmt sein, um die urogenitale Öffnung zu vermeiden (Abbildung 1B). Befestigen Sie beim Aufstellen des Retraktors den Pfosten für den Omni- oder Bookwalter-Retraktor an der linken, unteren Ecke des Tisches. Die ideale Retraktion umfasst zwei Retraktorklingen für die rechte Bauchdecke, zwei für die linke Ba…

Discussion

Die Xenotransplantation von Pankreasinseln mit Schweinespendern ist eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Typ-I-Diabetes. Die Isolierung von Inselzellen ist eine Herausforderung, und die Lebensfähigkeit und Ausbeute der endgültigen Inselzellen sind sehr anfällig für Hypotonie und Gewebeischämie, die bei der Organentnahme auftreten16,17. Um die Beschaffung und den Erhalt der Bauchspeicheldrüse zu optimieren, st…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Manuskript wurde durch ein klinisches Innovationsstipendium der Mid-America Transplant Foundation unterstützt.

Materials

1 M NaOH, 100 mL Millipore Sigma 1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C) Thermo Fisher 14065056
1x D-PBS, 500 mL Thermo Fisher 14200075
1x HBSS, 1 L Thermo Fisher 14025076
250 mL Conical Tubes Millipore Sigma CLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg] Millipore Sigma PHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10% Millipore Sigma 25655-41-8
BioRad Gradient Former BioRad 395
Calcium Chloride dihydrate Thermo Fisher 10035-04-8
COBE Cell Processor Ebay 317690 
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L Thermo Fisher 10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO) Thermo Fisher 85190
Dithizone Thermo Fisher 60-10-6
Gradient Former Connection Kit BioRad 1652008
Heparin [1000 U/mL] Emergency Medical Products 0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mL Thermo Fisher 15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mL Celprogen HSA2001-25-1
Isoflurane Covetrus Item#:11695067772
Ketamine Patterson Item #:07-894-8462
Liberase (100 mg) Millipore Sigma 5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermo Fisher L3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mL Cedarlane Labs CL5020
Masterflex LS 16 Tubing Masterfle 96419-16
Masterflex Peristaltic Pump Masterflex 07522-30
PenStrep (2 mg/mL) Celprogen PS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial) Dornase Alfa 8931278
Recovery Medium, PIM(R) Prodo Laboratories, Inc. PIM-R001GMP
RPMI 1640 Millipore Sigma R8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S) Prodo Laboratories, Inc. PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C Patterson Item #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L Global Transplant Solutions 1000-0046-06
Waterbath Sigma Alderich CLS6783-1EA
Xylazine Patterson Item #:07-891-6165

Referenzen

  1. Gillespie, K. M. Type 1 diabetes: pathogenesis and prevention. CMAJ. 175 (2), 165-170 (2006).
  2. Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nat Rev Endocrinol. 13 (5), 268-277 (2017).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Anazawa, T., et al. Improved method of porcine pancreas procurement with arterial flush and ductal injection enhances islet isolation outcome. Transplant Proc. 42 (6), 2032-2035 (2010).
  5. Dufrane, D., et al. Parameters favouring successful adult pig islet isolations for xenotransplantation in pig-to-primate models. Xenotransplantation. 13 (3), 204-214 (2006).
  6. Hilling, D. E., Rijkelijkhuizen, J. K., Tons, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Porcine islet isolation outcome is not affected by the amount and distribution of collagen in the pancreas. Xenotransplantation. 17 (3), 250-255 (2010).
  7. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  8. Otsuka, R., et al. Pancreas preservation with a neutrophil elastase inhibitor, alvelestat, contributes to improvement of porcine islet isolation and transplantation. J Clin Med. 11 (15), 4290 (2022).
  9. Vanderschelden, R., Sathialingam, M., Alexander, M., Lakey, J. R. T. Cost and scalability analysis of porcine islet isolation for islet transplantation: comparison of juvenile, neonatal and adult pigs. Cell Transplant. 28 (7), 967-972 (2019).
  10. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. 21 (6), 574-581 (2014).
  11. Hart, N. A., et al. Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver. Transpl Int. 20 (4), 343-352 (2007).
  12. Tullius, S. G., et al. Accumulation of crystal deposits in abdominal organs following perfusion with defrosted University of Wisconsin solutions. Am J Transplant. 2 (7), 627-630 (2002).
  13. Ching, C. D., et al. A reliable method for isolation of viable porcine islet cells. Arch Surg. 136 (3), 276-279 (2001).
  14. Lu, Y., et al. Adult pig islet isolation. J Vis Exp. (176), (2021).
  15. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplant. 19 (5), 613-628 (2010).
  16. Iwanaga, Y., Sutherland, D. E., Harmon, J. V., Papas, K. K. Pancreas preservation for pancreas and islet transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13 (4), 445-451 (2008).
  17. Pratschke, J., et al. Brain death and its influence on donor organ quality and outcome after transplantation. Transplantation. 67 (3), 343-348 (1999).
  18. vander Windt, D. J., et al. Early islet damage after direct exposure of pig islets to blood: has humoral immunity been underestimated. Cell Transplant. 21 (8), 1791-1802 (2012).
  19. Wright, M. J., Cavanagh, T. J., Fetterhoff, T. J., Wile, K. J. Effect of blood content on porcine pancreatic dissociation and islet yield. Transplant Proc. 26 (6), 3442 (1994).
  20. Toso, C., et al. Isolation of adult porcine islets of Langerhans. Cell Transplant. 9 (3), 297-305 (2000).

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Diesen Artikel zitieren
Roberts, S. H., Alrata, L., Abdulsattar, D., Joseph, K., Abu-Amer, W., Zaghloul, M., Arif, B., Alhamad, T., Remedi, M. S., Lin, Y., Zayed, M. A. Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation. J. Vis. Exp. (208), e66350, doi:10.3791/66350 (2024).

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