Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entnahme einer Bauchspeicheldrüse des Schweins für die Isolierung und Reinigung von Inselzellen.
Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine aufstrebende Behandlung von Typ-I-Diabetes. Sie ist jedoch durch die Zuordnung und Verfügbarkeit von Spendern begrenzt. Die Xenotransplantation von Schweineinseln bietet eine vielversprechende Alternative zur Allotransplantation mit dem Potenzial für die großtechnische Produktion von funktionellen Inselzellen auf Abruf. Die Ausbeute und Lebensfähigkeit isolierter Inselzellen hängt stark von der Qualität der Spender-Bauchspeicheldrüse und der Art der Gewinnung ab, insbesondere von der Dauer der Warm-Ischämie-Zeit. Um die Organkonservierung und die anschließende Ausbeute und Lebensfähigkeit der Inselzellen zu verbessern, haben wir ein Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins entwickelt. Dieses Protokoll verwendet eine direkte infrarenale Aortenkanüle und Organperfusion, um sowohl die Zeit der warmen Ischämie zu minimieren als auch das Verfahren für Bediener zu vereinfachen, die nicht über umfangreiche chirurgische Erfahrung verfügen. Durch die anschließende arterielle Perfusion der Bauchspeicheldrüse über die Aorta wird stagnierendes Blut aus den Mikrogefäßen gespült, wodurch Thrombosen und oxidative Schäden am Gewebe reduziert werden. Dieses Manuskript enthält ein detailliertes Protokoll für die chirurgische Perfusion und Resektion der Bauchspeicheldrüse des Schweins, gefolgt von der Isolierung und Reinigung der Inselzellen.
Typ-1-Diabetes wird durch die autoimmune Zerstörung von Betazellen der Bauchspeicheldrüse verursacht1. Folglich sind die Patienten auf exogenes Insulin angewiesen, was sie einem hohen Risiko für glykämische Schwankungen mit Episoden von Hyper- und Hypoglykämie aussetzt2. Die Insel-Allotransplantation ist ein potenzielles Heilmittel für Typ-I-Diabetes. Die begrenzte Verfügbarkeit von Organspendern für die Bauchspeicheldrüse ist jedoch nach wie vor ein großes Hindernis für die breite Einführung des Verfahrens 2,3. Die Insel-Xenotransplantation von Schweinespendern ist eine vielversprechende Alternative, da diese Tiere leicht verfügbar sind. Die Optimierung und Skalierung der Isolierung von Pankreasinseln von Schweinen wird für den Fortschritt der Insel-Xenotransplantation von entscheidender Bedeutung sein.
Obwohl bereits mehrere Techniken zur Entnahme der Bauchspeicheldrüse von Schweinen veröffentlicht wurden, beschreiben viele dieser Verfahren die Pankreeatomie nach Induktion des Herztodes oder der Exsanguination 4,5,6,7,8,9,10. Ein großer Nachteil dieser Techniken ist die variable warme ischämische Zeit (WIT), die zwischen dem Zeitpunkt des Herztodes und dem Beginn der intraarteriellen und/oder intraduktalen Infusion der Konservierungslösung auftritt. Bereits 10 Minuten WIT wirken sich negativ auf den Ertrag und die Rentabilität der Inselzellenaus 5. Die Minimierung der WIT erfordert eine sofortige Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit einer Konservierungslösung. Bei der Entnahme von Bauchorganen ist die Kanülierung der Aorta mit anschließender intrakorporaler Perfusion mit der Lösung der University of Wisconsin (UW) von entscheidender Bedeutung für die Blutentfernung, die Vorbeugung intravaskulärer Thrombosen, den Schutz vor ischämischen Schäden und die Minimierung von Zellschäden11,12.
Frühere Studien haben gezeigt, dass bei der Entnahme der Bauchspeicheldrüse des Schweins die Niederdruckspülung des Truncus coeliacus und der Arteria mesenterica superior mit UW-Lösung die Ausbeute und Reinheit der Inselzellen verbessert4. Zu den bisher veröffentlichten Methoden zur Entnahme der Bauchspeicheldrüse von Schweinen gehört jedoch die Kanülierung der offenen Aorta, die insbesondere bei kleineren Schweinen eine technische Herausforderung darstellen kann 13,14,15. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll mit begleitenden visuellen Hilfsmitteln für die chirurgische Perfusion und Entnahme der Bauchspeicheldrüse des Schweins vor, gefolgt von der Isolierung und Reinigung der Inselzellen. Diese neue Technik der Aortenkanülierung während der Pankreasisolierung wurde speziell entwickelt, um den WIT zu minimieren und die Pankreasbeschaffung in einem blutleeren Feld durchzuführen, um die Ausbeute und Lebensfähigkeit der Inselisolierung zu maximieren.
Die Xenotransplantation von Pankreasinseln mit Schweinespendern ist eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Typ-I-Diabetes. Die Isolierung von Inselzellen ist eine Herausforderung, und die Lebensfähigkeit und Ausbeute der endgültigen Inselzellen sind sehr anfällig für Hypotonie und Gewebeischämie, die bei der Organentnahme auftreten16,17. Um die Beschaffung und den Erhalt der Bauchspeicheldrüse zu optimieren, st…
The authors have nothing to disclose.
Dieses Manuskript wurde durch ein klinisches Innovationsstipendium der Mid-America Transplant Foundation unterstützt.
1 M NaOH, 100 mL | Millipore Sigma | 1310-73-2 | |
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C) | Thermo Fisher | 14065056 | |
1x D-PBS, 500 mL | Thermo Fisher | 14200075 | |
1x HBSS, 1 L | Thermo Fisher | 14025076 | |
250 mL Conical Tubes | Millipore Sigma | CLS430236-6EA | |
Amphotericin B [50 mg] | Millipore Sigma | PHR1662 | |
Antiseptic Povidone Iodine 10% | Millipore Sigma | 25655-41-8 | |
BioRad Gradient Former | BioRad | 395 | |
Calcium Chloride dihydrate | Thermo Fisher | 10035-04-8 | |
COBE Cell Processor | Ebay | 317690 | |
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L | Thermo Fisher | 10341001 | |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher | 85190 | |
Dithizone | Thermo Fisher | 60-10-6 | |
Gradient Former Connection Kit | BioRad | 1652008 | |
Heparin [1000 U/mL] | Emergency Medical Products | 0409-2720-01 | |
HEPES Buffer (1 M), 100 mL | Thermo Fisher | 15630080 | |
Human Serum Albumin 25%, 100 mL | Celprogen | HSA2001-25-1 | |
Isoflurane | Covetrus | Item#:11695067772 | |
Ketamine | Patterson | Item #:07-894-8462 | |
Liberase (100 mg) | Millipore Sigma | 5401020001 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher | L3224 | |
Lympholyte 1.1 Media 500 mL | Cedarlane Labs | CL5020 | |
Masterflex LS 16 Tubing | Masterfle | 96419-16 | |
Masterflex Peristaltic Pump | Masterflex | 07522-30 | |
PenStrep (2 mg/mL) | Celprogen | PS-30-002 | |
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial) | Dornase Alfa | 8931278 | |
Recovery Medium, PIM(R) | Prodo Laboratories, Inc. | PIM-R001GMP | |
RPMI 1640 | Millipore Sigma | R8758-1L | |
Standard Culture Medium, PIM(S) | Prodo Laboratories, Inc. | PIM-S001GMP | |
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C | Patterson | Item #:07-894-6240 | |
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L | Global Transplant Solutions | 1000-0046-06 | |
Waterbath | Sigma Alderich | CLS6783-1EA | |
Xylazine | Patterson | Item #:07-891-6165 |