In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor durch Einführung geeigneter Restriktionsstellen am 3′-Ende der Inserts zu erhalten. Wir können den Vektor linearisieren und DNA-Fragmente durch homologe Rekombinationstechnologie nacheinander mit dem Vektor verbinden.
Die Konstruktion von Genexpressionsvektoren ist ein wichtiger Bestandteil der Laborarbeit in der experimentellen Biologie. Mit technischen Fortschritten wie Gibson Assembly wird die Vektorkonstruktion relativ einfach und effizient. Wenn jedoch das Genom des Porcinen Reproduktiven und Respiratorischen Syndroms Virus (PRRSV) nicht einfach durch eine einzelne Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus cDNA amplifiziert werden kann oder es schwierig ist, einen Genexpressionsvektor in voller Länge durch homologe Rekombination mehrerer Inserts in vitro zu erhalten, kann die derzeitige Gibson-Assemblierungstechnik dieses Ziel nicht erreichen.
Daher zielten wir darauf ab, das PRRSV-Genom in mehrere Fragmente zu zerlegen und geeignete Restriktionsstellen in den reversen Primer einzuführen, um PCR-amplifizierte Fragmente zu erhalten. Nach dem Verbinden des vorherigen DNA-Fragments mit dem Vektor durch homologe Rekombinationstechnologie erhielt der neue Vektor die Spaltstelle des Restriktionsenzyms. So können wir den Vektor linearisieren, indem wir die neu hinzugefügte Enzymspaltstelle verwenden und das nächste DNA-Fragment stromabwärts des stromaufwärts gelegenen DNA-Fragments einführen.
Die eingeführte Spaltstelle des Restriktionsenzyms am 3′-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments wird eliminiert, und eine neue Spaltstelle wird in das 3′-Ende des stromabwärts gelegenen DNA-Fragments eingeführt. Auf diese Weise können wir DNA-Fragmente nacheinander mit dem Vektor verbinden. Diese Methode ist anwendbar, um den PRRSV-Expressionsvektor erfolgreich zu konstruieren, und ist eine effektive Methode zum Assemblieren einer großen Anzahl von Fragmenten in den Expressionsvektor.
Als wesentliche Technik zur Konstruktion von DNA-basierten experimentellen Werkzeugen für die Expression in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ist die molekulare Klonierung ein sehr wichtiger Bestandteil der experimentellen Biologie. Die molekulare Klonierung umfasst vier Prozesse: die Gewinnung von Insert-DNA, die Ligation des Inserts in den entsprechenden Vektor, die Umwandlung des rekombinanten Vektors in Escherichia coli (E. coli) und die Identifizierung der positiven Klone1. Bisher wurden mehrere Methoden zur Verbindung von DNA-Molekülen unter Verwendung der Restriktionsenzyme 2,3 und der PCR-vermittelten Rekombination 4,5,6 angewendet. Die homologe Rekombination, bekannt als Seamless Cloning Technology, ist die Gruppe von Klonierungsmethoden, die das sequenzunabhängige und narbenfreie Einfügen eines oder mehrerer DNA-Fragmente in einen Vektor ermöglicht. Diese Technologie umfasst sequenz- und ligationsunabhängige Klonierung (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion und Gibson Assemblierung. Es verwendet eine Exonuklease, um einen Strang des Inserts abzubauen, und einen Vektor, um kohäsive Enden zu erzeugen, und entweder in vivo-Reparatur oder in vitro-Rekombination, um das Insert durch Bildung von Phosphodiesterbindungen kovalent mit dem Vektor zu verbinden. Die Möglichkeit, einen einzelnen Insert in beliebiger Sequenz ohne Narben mit einem Vektor zu verbinden, ist sehr ansprechend. Darüber hinaus ist die Technologie in der Lage, 5-10 Fragmente in einer vorgegebenen Reihenfolge ohne Sequenzbeschränkungen zu verbinden.
Als eine von vielen rekombinanten DNA-Techniken ist die Gibson-Assemblierungstechnik, derzeit die effektivste Klonierungsmethode 7,8, eine robuste und elegante Exonuklease-basierte Methode, um ein oder mehrere linearisierte DNA-Fragmente nahtlos zusammenzusetzen. Die Gibson-Assemblierungsreaktion wird unter isothermen Bedingungen unter Verwendung einer Mischung aus drei Enzymen durchgeführt, nämlich 5′-Exonuklease, High-Fidelity-Polymerase und einer thermostabilen DNA-Ligase. Einzelstrangige 3′-Überhänge, die durch die 5′-3′-Exonuklease erzeugt werden, tragen zum Glühen von Fragmenten bei, die an einem Ende Komplementarität aufweisen. Die High-Fidelity-Polymerase füllt effektiv die Lücken in den geglühten Einzelstrangbereichen durch Zugabe von dNTPs, und die thermostabile DNA-Ligase dichtet die Kerben ab, um gemeinsame DNA-Molekülezu bilden 8. Daher ist diese technische Methode für die Konstruktion von Genexpressionsvektoren weit verbreitet.
Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom (PRRS) ist eine Viruserkrankung, die bei Schweinen ab einem Alter von9 Jahren zu Fortpflanzungsstörungen und Atemversagen führt, die durch PRRSV verursacht werden. Das Syndrom manifestiert sich in Form von Fieber, Magersucht, Lungenentzündung, Lethargie, Depression und Atemnot. Darüber hinaus wurden bei einigen Epidemien klinische Symptome, einschließlich roter/blauer Verfärbung der Ohren, beobachtet. Als Mitglied der Familie der Arteriviren wird PRRSV in großem Umfang durch direkten Kontakt und Austausch von Flüssigkeiten, einschließlich Urin, Kolostrum und Speichel, in die schweinefleischproduzierenden Länder übertragen. Aufgrund der Ausbreitung von PRRSV in den Vereinigten Staaten werden die wirtschaftlichen Gesamtverluste der Schweinefleischindustrie auf etwa 664 Millionen US-Dollar pro Jahr geschätzt, basierend auf dem Zuchtmaßstab von 5,8 Millionen Sauen und 110 Millionen Schweinen10,11. Der Bericht des Tier- und Pflanzengesundheitsinspektionsdienstes zeigt, dass 49,8 % der ungeimpften Schweine das Vorhandensein von PRRSV im Serum12 aufweisen und geringe PRRSV-Konzentrationen bei infizierten Schweinen über Speichel, Nasensekret, Urin und Kot ausgeschieden werden13. Es wurden mehrere Strategien implementiert, um die Ausbreitung von PRRSV zu kontrollieren 14,15,16. Neben Eliminierungsverfahren zur Schaffung vollständig virusnegativer Populationen oder zur Verbesserung der Biosicherheit und des Managements ist die Verabreichung von Impfstoffen ein wirksames Mittel zur Kontrolle von PRRS.
PRRSV ist ein behülltes, einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn und einer Länge von etwa 15 Kilobasen (kb). Das PRRSV-Genom besteht aus mindestens 10 offenen Leserahmen (ORFs), einer kurzen 5′-untranslatierten Region (5′ UTR) und einem Poly(A)-Schwanz am 3′-Ende (Abbildung 1A)17. Das Genom eines negativsträngigen RNA-Virus ist nicht infektiös, während das Genom von positivsträngigen RNA-Viren infektiös ist. Es gibt zwei Hauptstrategien für die RNA- und DNA-Transfektion zur Erzeugung von Virusnachkommen18. Die Klonierung des Fragments in voller Länge, das dem RNA-Genom entspricht, ist jedoch entscheidend für die Konstruktion infektiöser Klone. Aufgrund der langen und komplexen Natur des PRRSV-Genoms kann das Genom in voller Länge nicht einfach auf einmal durch PCR gewonnen werden. Obwohl die künstliche Synthese von PRRSV-Genen eine effektive Lösung ist, ist die Synthese langer Fragmente oft teuer. Um den PRRSV-Expressionsvektor in voller Länge zu erhalten, haben wir daher versucht, ihn mit der homologen Rekombinationsmethode19,20 mit mehreren Inserts zu erzeugen. Leider war es uns nicht möglich, den Genexpressionsvektor in voller Länge zu erhalten. Daher fügten wir in dieser Studie dem reversen Primer geeignete Restriktionsstellen hinzu und erhielten den pVAX1-PRRSV-Expressionsvektor erfolgreich durch mehrere Runden homologe Rekombinationsreaktionen. Darüber hinaus kann mit dieser Methode auch eine Deletion oder Mutation von Zielgenen erreicht und eine große Anzahl von DNA-Fragmenten effizient an den Expressionsvektor gebunden werden.
Die Gibson-Assemblierungstechnik ist eine auf In-vitro-Rekombination basierende molekulare Klonierungsmethode zur Assemblierung von DNA-Fragmenten8. Diese Methode ermöglicht den Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente zu einem zirkulären Plasmid in einer isothermen Reaktion mit einem einzigen Röhrchen. Eines der Hindernisse für die Gibson-Assemblierungstechnik ist jedoch die Gewinnung langer Fragmente aus cDNA. Die langen Fragmente sind aus vielen Gründen schwer genau zu vervielfältigen….
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die finanzielle Unterstützung der Promotionsanbahnungsmittel unterstützt, die von der China West Normal University (Nr. 20E059) zur Verfügung gestellt wurden.
1 kb plus DNA Ladder | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
Benchtop Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
Clean Bench | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
DNA Electrophoresis Equipment | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
DNA Loading Buffer (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
E. Z. N. A. Gel Extraction kit | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
Electro-heating Standing-temperature Cultivator | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
Goldview Nucleic Acid Gel Stain | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
Ice Maker Machine | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
LB Agar Plate (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
LB sterile liquid medium (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
Micropipettors | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
Microwave Oven | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
Orbital Shakers | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
PRRSV virus | Sichuan Agricultural University | — | |
SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | To design primers |
T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
TAE buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA extraction reagent |