गतिशील ग्लाइकोसोमल पीएच को मापना: लिविंग ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी में परिवर्तन
Summary
हम अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं कि पीएच अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम के रक्तप्रवाह रूप के ग्लाइकोसोम में पर्यावरणीय संकेतों का जवाब कैसे देता है। इस दृष्टिकोण में पीएच गतिशीलता को मापने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के साथ संयोजन में एक पीएच-संवेदनशील हेरिटेबल प्रोटीन सेंसर शामिल है, दोनों समय-पाठ्यक्रम परख के रूप में और एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन प्रारूप में।
Abstract
ग्लूकोज चयापचय अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम, ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी के लिए महत्वपूर्ण है, एक आवश्यक चयापचय प्रक्रिया और परजीवी विकास के नियामक के रूप में। पर्यावरणीय ग्लूकोज के स्तर में परिवर्तन होने पर उत्पन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बारे में बहुत कम जानकारी है। रक्तप्रवाह और प्रोसाइक्लिक रूप (कीट चरण) परजीवी दोनों में, ग्लाइकोसोम में अधिकांश ग्लाइकोलाइसिस होते हैं। ग्लूकोज की कमी के जवाब में इन जीवों को तेजी से अम्लीकृत किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप हेक्सोकाइनेज जैसे ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों के एलोस्टेरिक विनियमन की संभावना होती है। पिछले काम में, पीएच माप बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली रासायनिक जांच का स्थानीयकरण चुनौतीपूर्ण था, अन्य अनुप्रयोगों में इसकी उपयोगिता को सीमित करना।
यह पत्र परजीवी के विकास और उपयोग का वर्णन करता है जो ग्लाइकोसोमली स्थानीयकृत pHluorin2, एक आनुवंशिक प्रोटीन पीएच बायोसेंसर व्यक्त करता है। pHluorin2 एक अनुपातमितीय pHluorin संस्करण है जो 395 एनएम पर उत्तेजना में पीएच (एसिड) पर निर्भर कमी प्रदर्शित करता है, साथ ही साथ 475 एनएम पर उत्तेजना में वृद्धि करता है। ट्रांसजेनिक परजीवी pHluorin2 ओपन रीडिंग फ्रेम को ट्रिपैनोसोम एक्सप्रेशन वेक्टर pLEW100v5 में क्लोन करके उत्पन्न किए गए थे, जो किसी भी जीवनचक्र चरण में इंड्यूसिबल प्रोटीन अभिव्यक्ति को सक्षम करते हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग pHluorin2 बायोसेंसर के ग्लाइकोसोमल स्थानीयकरण की पुष्टि करने के लिए किया गया था, जो बायोसेंसर के स्थानीयकरण की तुलना ग्लाइकोसोमल निवासी प्रोटीन एल्डोलेज़ से करता है। सेंसर जवाबदेही को 4 से 8 तक पीएच में फैले बफ़र्स की एक श्रृंखला में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके अलग-अलग पीएच स्तरों पर कैलिब्रेट किया गया था, एक दृष्टिकोण जिसे हमने पहले फ्लोरेसिन-आधारित पीएच सेंसर को कैलिब्रेट करने के लिए उपयोग किया था। फिर हमने ग्लाइकोसोमल पीएच निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके 405 एनएम और 488 एनएम पर पीएच 2 प्रतिदीप्ति को मापा। हमने लाइव ट्रांसजेनिक pHluorin2-व्यक्त परजीवी के प्रदर्शन को मान्य किया, ग्लूकोज अभाव के जवाब में समय के साथ पीएच की निगरानी की, पीएफ परजीवी में ग्लाइकोसोमल अम्लीकरण का एक ज्ञात ट्रिगर। इस उपकरण में संभावित अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला है, जिसमें संभावित रूप से उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग में उपयोग किया जा रहा है। ग्लाइकोसोमल पीएच से परे, सेंसर को अन्य ऑर्गेनेल के अनुकूल बनाया जा सकता है या लाइव सेल सेटिंग में पीएच गतिशीलता को समझने के लिए अन्य ट्रिपैनोसोमैटिड्स में उपयोग किया जा सकता है।
Introduction
परजीवी कीनेटोप्लास्टिड्स, अधिकांश जीवित जीवों की तरह, केंद्रीय कार्बन चयापचय के मूलभूत घटक के रूप में ग्लूकोज पर भरोसा करते हैं। इस समूह में चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण जीव शामिल हैं, जैसे कि अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम, ट्रिपैनोसोमा ब्रुसी; अमेरिकी ट्रिपैनोसोम, टी। और जीनस लीशमैनिया के परजीवी। रोगजनक जीवनचक्र चरणों में परजीवी वृद्धि के लिए ग्लूकोज चयापचय महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज से वंचित होने पर, अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम का रक्तप्रवाह रूप (बीएसएफ) तेजी से मर जाता है। विशेष रूप से, ग्लाइकोलाइसिस संक्रमण के इस चरण के दौरान एटीपी के एकमात्र स्रोत के रूप में कार्य करताहै। लीशमैनिया परजीवी इसी तरह मानव मेजबान में ग्लूकोज पर निर्भर होते हैं, एमास्टिगोट जीवनचक्र चरण के साथ जो मेजबान मैक्रोफेज में रहता है जो विकास के लिए इस कार्बन स्रोत पर निर्भर करताहै।
जबकि इन परजीवियों में अलग-अलग कीट वैक्टर शामिल हैं, वे कई समानताएं साझा करते हैं कि वे ग्लूकोज का जवाब और उपभोग कैसे करते हैं। उदाहरण के लिए, ये परजीवी अधिकांश ग्लाइकोलाइटिक एंजाइमों को ग्लाइकोसोम नामक संशोधित पेरोक्सीसोम में स्थानीयकृत करते हैं। यह कीनेटोप्लास्टिड-विशिष्ट ऑर्गेनेल संरक्षित बायोसिंथेटिक तंत्र औरआकृति विज्ञान 3,4,5,6के आधार पर स्तनधारी पेरोक्सीसोम से संबंधित है।
ग्लाइकोसोम में अधिकांश ग्लाइकोलाइटिक मार्ग एंजाइमों का कम्पार्टमेंटलाइजेशन मार्ग के नियमन के परजीवी-विशिष्ट साधन प्रदान करता है। एक रासायनिक पीएच जांच का उपयोग करते हुए, हमने स्थापित किया कि पोषक तत्वों की कमी प्रोसाइक्लिक फॉर्म (पीएफ) परजीवी ग्लाइकोसोम के तेजी से अम्लीकरण को ट्रिगर करती है जिसके परिणामस्वरूप प्रमुख ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम हेक्सोकाइनेज 7,8पर एलोस्टेरिक नियामक बाध्यकारी साइट के संपर्क के माध्यम से परिवर्तित ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम गतिविधि होती है। हमारे पिछले काम में, रासायनिक जांच को उपयोग के लिए निरंतर वितरण की आवश्यकता होती है, अन्य अनुप्रयोगों में इसकी उपयोगिता को सीमित करता है। इसके अतिरिक्त, बीएसएफ में ग्लाइकोसोम में जांच वितरण को बनाए रखने की चुनौतियों ने उस जीवन चरण में ग्लाइकोसोमल पीएच की जांच के लिए दृष्टिकोण की उपयोगिता को सीमित कर दिया।
इस अध्ययन में, हमने ग्लूकोज भुखमरी9 (चित्रा 1) सहित पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में बीएसएफ टी ब्रुसी में ग्लाइकोसोमल पीएच परिवर्तन की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन बायोसेंसर पीएच 2 का उपयोग किया है। इस काम के परिणाम बताते हैं कि बीएसएफ टी ब्रुसी एक प्रतिवर्ती फैशन में भुखमरी के जवाब में ग्लाइकोसोम को तेजी से अम्लीकृत करता है, जैसा कि हमने पीएफ परजीवी में देखा है। हम उम्मीद करते हैं कि यह बायोसेंसर ग्लाइकोलाइटिक विनियमन की हमारी समझ में सुधार करेगा टी।
Protocol
Representative Results
Discussion
अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम में पर्यावरण की धारणा और प्रतिक्रिया तंत्र को खराब समझा जाता है। पोषक तत्वों की उपलब्धता में परिवर्तन परजीवी में विविध प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए जाना जाता है, जिसमें ग्…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 को ट्विस्ट बायोसाइंस द्वारा pLEW100v5 में क्लोन किया गया था, जिसने एक उच्च-कॉपी क्लोनिंग वेक्टर में निर्माण प्रदान किया था; pLEW100v5 डॉ जॉर्ज क्रॉस से एक उपहार था। टी. ब्रुसी एल्डोलेज़ के खिलाफ उठाया गया एंटीसेरम अनुरोध पर डॉ. मेरेडिथ टी. मॉरिस, क्लेम्सन विश्वविद्यालय से उपलब्ध है। जेसीएम और केएसी प्रयोगशालाओं के काम को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01AI156382) के एक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। एसएसपी को एनआईएच 3R01AI156382 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
Referenzen
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