Die Erforschung des zellulären Verhaltens unter mechanischer Belastung ist entscheidend für Fortschritte in der Zellmechanik und Mechanobiologie. Wir stellen die Fluoreszenz-Mikropipetten-Aspirationstechnik (fMPA) vor, eine neuartige Methode, die kontrollierte mechanische Stimulation mit einer umfassenden Analyse der intrazellulären Signalübertragung in einzelnen Zellen kombiniert. Diese Technik untersucht neue eingehende Studien der Mechanobiologie lebender Zellen.
Mikropipetten-Aspirationsassays sind seit langem ein Eckpfeiler für die Untersuchung der Mechanik lebender Zellen und bieten Einblicke in die zellulären Reaktionen auf mechanischen Stress. In diesem Artikel wird eine innovative Anpassung des fluoreszenzgekoppelten Mikropipettenaspirationsassays (fMPA) beschrieben. Der fMPA-Assay bietet die Möglichkeit, präzise mechanische Kräfte zu verabreichen und gleichzeitig die durch Ionenkanäle vermittelten Mechanotransduktionsprozesse in lebenden Zellen zu überwachen. Der ausgeklügelte Aufbau umfasst eine präzisionsgefertigte Mikropipette aus Borosilikatglas, die mit einem fein regulierten Wasserreservoir und einem pneumatischen Absaugsystem verbunden ist und eine kontrollierte Druckanwendung mit Schritten von bis zu ± 1 mmHg ermöglicht. Eine wesentliche Verbesserung ist die Integration der Epi-Fluoreszenz-Bildgebung, die die gleichzeitige Beobachtung und Quantifizierung von zellmorphologischen Veränderungen und intrazellulären Kalziumflüssen während der Aspiration ermöglicht. Der fMPA-Assay setzt durch seine synergistische Kombination von Epifluoreszenz-Bildgebung und Mikropipettenaspiration einen neuen Standard für die Untersuchung der Zell-Mechanosensorik in mechanisch anspruchsvollen Umgebungen. Dieser facettenreiche Ansatz ist an verschiedene Versuchsaufbauten anpassbar und bietet wichtige Einblicke in die einzelligen Mechanosensormechanismen.
Die sich entfaltenden Entdeckungen in der Welt des zellulären Verhaltens haben die Rolle mechanischer Reize wie Spannung, Flüssigkeitsscherspannung, Kompression und Substratsteifigkeit bei der Bestimmung dynamischer zellulärer Aktivitäten wie Adhäsion, Migration und Differenzierung akzentuiert. Diese mechanobiologischen Aspekte sind von größter Bedeutung für die Aufklärung, wie Zellen mit ihrer physiologischen Umgebung interagieren und darauf reagieren, was sich auf verschiedene biologische Prozesse auswirkt 1,2.
In den letzten zehn Jahren haben sich Mikropipetten-basierte Aspirationsassays als vielseitiges Werkzeug bei der Untersuchung verschiedener zellulärer Reaktionen auf mechanische Reize erwiesen. Diese Technik bietet wertvolle Einblicke in die intrinsischen mechanischen Eigenschaften lebender Zellen auf Einzelzellebene, einschließlich zellulärem Elastizitätsmodul, Steifigkeit und kortikaler Spannung. Diese Assays ermöglichen die Messung verschiedener mechanischer Parameter, wie z. B. der Zellmembranspannung, des auf die Zellmembran ausgeübten Drucks und der kortikalen Spannung (zusammengefasst in Tabelle 1). Die Untersuchung der Aspirationskräfte hat unser Verständnis darüber bereichert, wie sie zelluläre Funktionen und Prozesse beeinflussen, insbesondere im Bereich der Membrandynamik, einschließlich Fragmentierung, Dehnung und Knospung 3,4.
Mechanische Parameter | Beschreibung | Wegweisende Ansätze |
Zellsteifigkeit | Messung der mechanischen Steifigkeit und Elastizität einer Zelle. | Aspiration der Zellmembran und Analyse der Verformungsreaktion auf den Unterdruck20,21. |
Haftfestigkeit | Bewertung, wie stark Zellen an Oberflächen haften. | Anwendung einer kontrollierten Absaugung zum Ablösen anhaftender Zellen von einem Substrat2,22. |
Membranspannung | Beurteilung der Spannung oder Spannung innerhalb der Zellmembranen. | Messung der Membranverformung als Reaktion auf angelegten Druck23,24. |
Viskoelastische Eigenschaften | Charakterisierung des kombinierten viskosen und elastischen Verhaltens einer Zelle. | Analyse der zeitabhängigen Verformungsreaktion auf Aspiration23,25. |
Verformbarkeit | Bestimmung, wie leicht eine Zelle ihre Form ändern kann. | Bewertung des Ausmaßes der Verformung unter kontrollierter Absaugung20,24. |
Oberflächenspannung | Messung der Spannung an der Zelloberfläche. | Beurteilung des Drucks, der erforderlich ist, um einen Membranvorsprung der Mikropipettezu bilden 26. |
Zell-Material-Interaktion | Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Zellen und Materialien oder Substraten. | Aspiration von Zellen in Kontakt mit verschiedenen Materialien und Beobachtung von Wechselwirkungen2,24. |
Zell-Zell-Interaktion | Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen. | Aspiration einer Gruppe von Zellen und Analyse ihrer interzellulären Kräfte27. |
Tabelle 1: Mechanische Parameter, die durch den Mikropipetten-Aspirationsassay charakterisiert werden.
Die auf Mikropipetten basierende Aspirationstechnik wird häufig zur Untersuchung roter Blutkörperchen (RBCs) eingesetzt, um die Verformbarkeit und verschiedene mechanische Eigenschaften von Erythrozyten zu bewerten, was für das Verständnis ihrer Funktion im Kreislaufsystem unerlässlich ist. Erythrozyten weisen eine bemerkenswerte Anpassungsfähigkeit auf und bewahren ihre mechanische Vielseitigkeit gegen Verformung beim Navigieren durch das komplizierte Kapillarnetzwerk und die interendothelialen Spalten 5,6. Während dieser Reise müssen RBCs Passagen von nur 0,5 bis 1,0 μm durchqueren und sich dabei einer Vielzahl mechanischer Kräfte aussetzen, einschließlich Zug und Druck 7,8,9. Sie haben auch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der Scherspannung, die durch den Blutfluss während des Kreislaufs erzeugtwird 10. Diese Prozesse fördern die Aktivierung von Regulationsmechanismen, die den Kalziumeinstrom betreffen, ein entscheidendes Signalereignis mit einer gut etablierten Rolle bei der zellulären Reaktion auf mechanische Reize11,12. Die komplexen Mechanismen, die die Kalzium-vermittelte Mechanosensorik steuern, sind nach wie vor Gegenstand anhaltender Untersuchungen.
In diesem Zusammenhang stellt die fMPA einen effektiven Ansatz dar, um das Ausmaß der Calciummobilisierung unter genau kontrollierten mechanischen Kräften aufzudecken und gleichzeitig die mechanische Modulation (mit dem Mikropipetten-Aspirationssystem) und die Visualisierung der Calciumintensität (mit Fluoreszenzindikatoren) zu ermöglichen. Es ahmt insbesondere das physiologische Szenario nach, wenn die Erythrozyten durch verengte Blutgefäße wandern. Es ist erwähnenswert, dass das von uns entwickelte fMPA-System Druck mit einer Auflösung von 1 mmHg erzeugen kann. Die implementierte Hochgeschwindigkeitskamera kann eine zeitliche Auflösung von 100 ms und eine räumliche Auflösung im Submikrometerbereich erreichen. Diese Konfigurationen gewährleisten die präzise Anwendung mechanischer Kräfte auf lebende Zellen und erfassen gleichzeitig die resultierende zelluläre Signalübertragung. Darüber hinaus kann der Mikropipetten-Aspirationsassay aufgrund des integrativen technischen Charakters dieses Aufbaus leicht an andere Geräte oder Techniken angepasst werden, was eine weitere Erforschung der Feinheiten der Zellmechanik ermöglicht. Diese Vielseitigkeit ist ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes.
Mikropipetten-Aspirationsassays verkörpern eine verfeinerte Methodik, die eine erhebliche Druckmodulation, eine exakte räumliche Orchestrierung und ein zuverlässiges zeitliches Unterscheidungsvermögen einsetzt, um die tiefgreifenden Feinheiten der zellulären Biomechanik zu untersuchen. Diese Studie legt besonderen Wert auf die Anwendung von fMPA als entscheidendes Werkzeug zur Enthüllung der nuancierten mechanosensitiven Reaktionen, die von Erythrozyten unter unterschiedlichen Stimuli gezeigt werden. Die gleichzeit…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Nurul Aisha Zainal Abidin und Laura Moldovan für die zusätzliche Spenderrekrutierung, Blutentnahme und Unterstützung bei der Phlebotomie. Wir danken Tomas Anderson und Arian Nasser für die Organisation der Ausrüstung und Reagenzien. Diese Forschung wurde vom Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); der National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); NHMRC-Ausrüstungszuschuss-L.A.J.; NSW Programm zum Aufbau kardiovaskulärer Kapazitäten (Early-Mid Career Researcher Grant-L.A.J.); NSW CVRN-VCCRI Forschungsinnovationszuschuss; Büro für globales und wissenschaftliches Engagement (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. ist ein National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2 (105863) und ein Snow Medical Research Foundation Fellow (2022SF176).
µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
DAQami | Diligent | ||
Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
Imaris | Oxford Instruments | ||
Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation – 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water – Final pH = 8-9. |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation – 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water – Final pH = 8-9. |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) |
Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |