Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine praktische Strategie, um den Verifizierungsschritt stereotaktischer Injektionskoordinaten zu beschleunigen, bevor die Virusverfolgung mit Farbstoffen und Gefrierschnitten durchgeführt wird.
Abstract
Die stereotaktische Injektion einer bestimmten Hirnregion stellt eine grundlegende experimentelle Technik in den Neurowissenschaften dar. Forscher stützen sich bei der Wahl der stereotaktischen Injektionsparameter häufig auf Hirnatlanten von Mäusen oder veröffentlichten Materialien, die verschiedene Populationen/Altersgruppen von Mäusen und unterschiedliche stereotaktische Geräte verwendeten, was eine weitere Validierung der stereotaktischen Koordinatenparameter erforderlich machte. Die Wirksamkeit von Calcium-Bildgebung, chemogenetischen und optogenetischen Manipulationen beruht auf der präzisen Expression von Reportergenen innerhalb der interessierenden Region, die oft mehrere Wochen Aufwand erfordert. Daher ist es eine zeitaufwändige Aufgabe, wenn die Koordinaten der Zielhirnregion nicht im Voraus verifiziert werden. Mit einem geeigneten Farbstoff anstelle eines Virus und der Durchführung von Kryosektionen können die Forscher die Injektionsstelle unmittelbar nach der Farbstoffverabreichung beobachten. Dies ermöglicht eine rechtzeitige Anpassung der Koordinationsparameter in Fällen, in denen Diskrepanzen zwischen der tatsächlichen Injektionsstelle und der theoretischen Position bestehen. Solche Anpassungen verbessern die Genauigkeit der viralen Expression innerhalb der Zielregion in nachfolgenden Experimenten erheblich.
Introduction
Nahezu alle modernen Neuromodulationswerkzeuge, einschließlich der In-vivo-Kalziumaufzeichnung, optogenetischer und chemogenetischer Werkzeuge, erfordern die Verwendung stereotaktischer Koordinaten, um den interessierenden Hirnbereich zu erreichen 1,2,3, was die Grundlage der neuronalen Manipulation bildet. Stereotaktische Koordinaten für Hirnregionen von Mäusen werden in Beziehung zu Bregma und Lambda, den knöchernen Landmarken auf dem Schädel, definiert, die das sogenannte skull-derived stereotaxic coordinate system bilden. Als Nullpunkt der dreidimensionalen Koordinaten kann entweder Bregma oder Lambda dienen. Die drei Achsen sind anteroposterior (AP), mediolateral (ML) und dorsoventral (DV) und stellen die y-, x- und z-Achsen auf der digitalen Anzeige stereotaktischer Instrumente dar. Für bekannte Hirnregionen können die stereotaktischen Koordinatenparameter eines bestimmten Bereichs aus Maushirnatlanten4 (z.B. Paxinos und Franklins Mausgehirn in stereotaktischen Koordinaten) und/oder der veröffentlichten Literatur 5,6 gewonnen werden. Eine weitere Validierung ist jedoch aufgrund von Unterschieden in der stereotaktischen Ausrüstung und dem Alter/der Populationen von Mäusen, die von verschiedenen Forschern verwendet werden, erforderlich.
Struktur ist die Basis der Funktion. Neuronale Schaltkreise bilden die Grundlage für viele Gehirnfunktionen, wie z. B. kognitive Aktivitäten, Emotionen, Gedächtnis, sensorische und motorische Funktionen1. Die Markierung der Struktur und die Manipulation der Aktivität neuronaler Schaltkreise sind entscheidend für das Verständnis der Funktion eines bestimmten neuronalen Schaltkreises. In den letzten Jahrzehnten haben sich neuronale Tracer über viele Generationen hinweg entwickelt; Frühe Forschungen verwendeten Weizenkeimaggglutinin (WGA) und Phaseolus vulgaris Agglutinin (PHA) als anterograde Tracer und Fluorgold (FG), Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) und Carbocyanin als retrograde Tracer. Im Gegensatz zu viralen Tracern können diese herkömmlichen neuronalen Tracer jedoch keine exogenen Gene in den Wirt integrieren und weisen auch keine Zelltypselektivität auf. Heutzutage ist die virale Strategie zu einem wichtigen Vorschlag in der neurowissenschaftlichen Grundlagenforschung geworden. Für unterschiedliche Forschungszwecke können verschiedene virale Werkzeuge ausgewählt werden 7,8. Es gibt nicht-transsynaptische Viren, trans-multisynaptische Viren (retrograd und anterograde) und trans-monosynaptische Viren (retrograd und anterograd). Jede Kategorie enthält mehrere Typen mit entsprechenden Merkmalen.
Der Prozess der viralen Verabreichung und Expression ist sehr zeit- und ressourcenintensiv und dauert oft Wochen oder sogar länger. Unter den verschiedenen viralen Vektoren wurde das Adeno-assoziierte Virus als vielversprechendes Mittel für die Genübertragung identifiziert, das ein breites Zeitfenster von 3 bis 8 Wochen nach der Injektion für das experimentelle Verfahren bietet 7,8. Mit fortschreitender AAV kann die Analyse 2-3 Wochen nach der Verabreichung durchgeführt werden 9,10. Andere Tracer für neuronale Schaltkreise, wie z. B. das Pseudotollwutvirus (PRV) und das Tollwutvirus (RV), erfordern ebenfalls einen Rückverfolgungszeitraum von mindestens 2-7 Tagen 11,12,13,14,15. Daher ist eine vorläufige Überprüfung der Injektionsstelle vor der Beobachtung von Fluoreszenzsignalen sowohl zeit- als auch kosteneffizient.
Um eine einfache und schnelle Überprüfung von stereotaktischen Injektionen zu ermöglichen, wird in dieser Studie ein Farbstoff vor viralen Vektoren verabreicht, und die Kryosektion ermöglicht es den Forschern, die Injektionsstelle zu beobachten und innerhalb von 30 Minuten nach der Injektion zu verfolgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wurde eine stabile Strategie beschrieben, um die Genauigkeit von stereotaktischen Hirninjektionen 5,6 schneller und einfacher vor der Virusverfolgung zu überprüfen, aber der unersetzliche Aspekt der Reportergenexpression in der Gehirnregion ist entscheidend für die Markierung von Hirnregionen. Der von uns verwendete blaue Farbstoff ermöglichte die unmittelbare Visualisierung der Injektionsstelle.
Mehrere kritische…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Natural Science Foundation of China (Stipendium Nr. 82101249 an XY Sun), Postdoctoral Research Foundation of China (Stipendium Nr. 2022M722125 an XY Sun). Shanghai Sailing Program (Zuschuss Nr. 21YF1425100 an SH Chen). Sonderprojekt für klinische Forschung der städtischen Gesundheitskommission von Shanghai (Zuschuss Nr. 202340088 an J Zhou). Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Stipendium Nr. 82101262 an X Zhang, Stipendium Nr. 82101287 an SH Chen).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
Referenzen
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
