Diese Studie nutzt die zweidimensionale Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (2D-HPLC-MS) Technologie in Verbindung mit molekularen Netzwerken, um die komplizierte chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze Aconitum pendulum Busch (APB) zu entschlüsseln. Der Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die systematische Erforschung und Identifizierung komplexer chemischer Bestandteile pflanzlicher Arzneimittel.
In dieser Studie wurde ein umfassender Ansatz verfolgt, bei dem die 2D-HPLC-MS-Technologie in Verbindung mit dem molekularen Netzwerk verwendet wurde, um die komplizierte chemische Zusammensetzung der tibetischen Heilpflanze APB zu entschlüsseln. Durch die Implementierung der 2D-HPLC wurde eine verbesserte Trennung komplexer Gemische erreicht, die die Isolierung einzelner Verbindungen für die anschließende Analyse ermöglicht. Der Ansatz des molekularen Netzwerks trug weiter zur Aufklärung der strukturellen Beziehungen zwischen diesen Verbindungen bei und trug zur Bestimmung potenzieller bioaktiver Moleküle bei. Diese integrierte Strategie identifizierte effizient eine breite Palette chemischer Komponenten, die in der Anlage vorhanden sind. Die Ergebnisse zeigten ein vielfältiges Spektrum chemischer Bestandteile innerhalb von APB, darunter Alkaloide. Diese Forschung fördert nicht nur das Verständnis des phytochemischen Profils dieser traditionellen tibetischen Medizin, sondern liefert auch wertvolle Einblicke in ihre potenziellen therapeutischen Eigenschaften. Die Integration von 2D-HPLC-MS und molekularem Netzwerk erweist sich als leistungsfähiges Werkzeug zur systematischen Erforschung und Identifizierung komplexer chemischer Zusammensetzungen in pflanzlichen Arzneimitteln und ebnet den Weg für weitere Forschung und Entwicklung im Bereich der Naturstoffentdeckung.
Die tibetische Medizin ist ein integraler Bestandteil der traditionellen chinesischen Medizin, die sich an die Prinzipien der tibetischen Medizin hält und zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten eingesetztwird 1. Die tibetische Kräutermedizin enthält jedoch komplexe pflanzliche chemische Bestandteile, die durch erhebliche Gehaltsschwankungen gekennzeichnet sind. Das begrenzte Verständnis der grundlegenden bioaktiven Elemente ist zu einem Engpass bei der Modernisierung der tibetischen Medizin geworden2. Die Anwendung der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), die die starke Trennkraft der Chromatographie mit der hohen Empfindlichkeit der Massenspektrometrie (MS) kombiniert, ist in der naturmedizinischen Analytik weit verbreitet3. Aufgrund der Beschränkung auf einen einzigen Trennmechanismus neigen Komponenten mit sehr ähnlichen Strukturen jedoch dazu, bei der eindimensionalen Flüssigkeitschromatographie-Trennung zu koelutieren. In der anschließenden massenspektrometrischen Analyse sind die koeluierten Komponenten mit geringer Abundanz aufgrund der Ionensuppression, die durch Komponenten mit hoher Abundanz verursacht wird, schwer zu detektieren4.
Die 2D-HPLC, die Abkürzung für zweidimensionale Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, stellt ein neuartiges chromatographisches Verfahren dar, das verschiedene Trennmechanismen mittels eines Säulenpaares harmonisch miteinander verbindet. Dies umfasst die Fusion oder Abwechslung der Normalphasenchromatographie mit der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie und der hydrophilen Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie mit der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie5. Durch die Zusammenführung dieser komplementären chromatographischen Eigenschaften wird die verbesserte Trennfähigkeit erreicht, wodurch die Herausforderungen, die durch komplexe Probenmatrizen verursacht werden, effektiv bewältigtwerden 6. Darüber hinaus können durch die Kopplung der zweidimensionalen Chromatographie mit MS die leistungsstarke Trennfähigkeit der 2D-HPLC und die hochempfindliche Detektionsfähigkeit der MS vollständig integriert werden, was die Untersuchung komplexer Wirkstoffsysteme und ihrer grundlegenden Bestandteile unterstützt 7,8,9.
Die tibetische Medizin zeichnet sich im Allgemeinen durch eine facettenreiche Palette von Komponenten und Funktionalitäten aus, wobei die Wirkstoffe in der Regel in komplizierten Zusammensetzungen und in minimalen Konzentrationen vorliegen. Durch die Integration von 2D-LC als robustem Trennsystem und MS als äußerst empfindlichem Detektor können die Herausforderungen, die komplizierte Proben in Bezug auf Trennung und Identifizierung mit sich bringen, effektiver bewältigt werden 10,11,12. Diese Verschmelzung trägt wesentlich dazu bei, die Erforschung der chemischen Zusammensetzung der tibetischen Medizin voranzutreiben.
Unabhängig davon, ob es sich um eine traditionelle LC-MS oder 2D-LC-MS handelt, kann eine große Menge an Informationen gewonnen werden. Die Extraktion von Strukturinformationen komplexer Systemkomponenten aus dieser riesigen Informationsmenge war jedoch schon immer eine große Herausforderung. Daher haben die Forscher verschiedene Methoden entwickelt, um MS-Daten zu screenen und zu verwerten. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) ist eine MS/MS-Datenorganisations- und Visualisierungsplattform, auf der 2D-LC-MS-Massenspektrometriedaten hochgeladen werden können13. Jedes Spektrum wird als Vektor betrachtet und mit allen anderen Spektren unter Verwendung der Kosinusähnlichkeit verglichen. Wenn die Ähnlichkeit zwischen zwei Spektren einen Schwellenwert überschreitet, werden sie in einem molekularen Netzwerk (MN) verbunden. Dies kann für die schnelle Identifizierung bekannter Verbindungen und die Bestimmung verschiedener unbekannter Naturstoffe verwendet werden14.
Die tibetische Medizin hat in der Regel mehrere Funktionen, aber ihre komplexe Zusammensetzung und ihre signifikanten Konzentrationsunterschiede machen es schwierig, den Zusammenhang zwischen Funktion und materieller Basis effektiv aufzuklären15. Eine vertiefte Beschäftigung mit der tibetischen Medizin erfordert die systematische Charakterisierung möglichst vieler Komponenten. Im Rahmen dieser Studie beabsichtigen wir, APB in der tibetischen Medizin als Forschungsobjekt zu verwenden, um die Strategie und den Prozess der systematischen Untersuchung der komplexen chemischen Komponenten der tibetischen Medizin mit Hilfe der 2D-HPLC-MS-Technologie und der MN-Technologie zu demonstrieren. Bei der Konstruktion des 2D-chromatographischen Systems haben wir die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie und die hydrophile Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie mit signifikanten Trennmechanismen kombiniert, um eine effektivere Trennung der komplexen Komponenten von APB16 zu erreichen. Um die Lösungsmittelinkompatibilität zwischen den beiden Dimensionen zu überwinden, wurde außerdem ein Verdünnungsmodulationsmodus an der Säule eingeführt. Durch die Kombination der leistungsstarken Trennfähigkeit von 2D-LC mit der hochempfindlichen Detektionsfähigkeit von MS werden die spektralen Informationen der komplexen Komponenten in APB effektiver und umfassender erhalten. Darüber hinaus werden durch die Vernetzung und Visualisierung massiver spektraler Informationen durch die MN-Technologie die Komponenten von APB systematisch analysiert. Es wird erwartet, dass die in dieser Studie gezeigte Strategie und der Prozess auf die Erforschung anderer tibetischer Arzneimittel angewendet werden und die Forschung über die materiellen Grundlagen der tibetischen Medizin fördern, was für die Förderung der Ressourcen der tibetischen Medizin und die Verbesserung der Qualitätskontrollstandards für tibetische Kräuter von großer Bedeutung ist17. Der gesamte Versuchsprozess ist in Abbildung 1 dargestellt.
In dem hier vorgestellten Experiment wurde ein neuer At-Säulen-Verdünnungsmodulator in das zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-System (2D-LC) von Agilent18 eingeführt. Durch das Hinzufügen einer unabhängigen Förderpumpe wurde der Strömungsweg der Analyse verändert, was zu einer hohen Orthogonalität der 2D-LC-Analyse führte. Das Ankuppeln und Umschalten zwischen den beiden Dimensionen erfolgt durch zwei Sechswegeventile, wie in Abbildung 2 dargestellt. Wenn eine Probenschleife in der ersten Dimension gefüllt ist, wird eine andere Probenschleife in der zweiten Dimension analysiert. Das bedeutet, dass die Füllzeit der 1D-Schleife und die Laufzeit der 2D gleich sind. Dies erfordert den schnellen Gradienten, der von der binären Pumpe in der zweiten Dimension erzeugt wird. Bei der Analyse des gesamten Abwassers gehen keine Spitzen verloren. Dies ist besonders hilfreich für die Analyse unbekannter Proben. Das Ergebnis ist eine große Anzahl von 2D-Chromatogrammen, die für die Datenanalyse kombiniert werden müssen.
Der Schwerpunkt dieses Versuchs lag auf der Optimierung eines partiellen Verfahrens im Rahmen der zweidimensionalen Flüssigphasentrennung. Um dies zu erreichen, wurde ein neuartiger At-Säulen-Verdünnungsmodulator nahtlos in das zweidimensionale Flüssigkeitschromatographie-System (2D-LC) integriert. Diese technische Anpassung war von größter Bedeutung, da sie die Fähigkeit zur Profilierung der chemischen Bestandteile der tibetischen Medizin, bekannt als APB, erheblich verbesserte. Die Integration der 2D-HPLC-MS-Tec…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde finanziert von der National Natural Science Foundation of China (82130113), der National Natural Science Foundation of China (82204765), der Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470), dem Sichuan Provincial Postdoctoral Special Funding Project (TB2023020) und dem Xinglin Scholars Research Promotion Program der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (BSH2021030). Mit diesen Mitteln werden Experimentiergeräte, experimentelle Materialien und Publikationsgebühren unterstützt.
Acetonitrile | Fisher chemical | F22M81203 | Mobile phase |
Aconitum pendulum | / | / | Herb medicine |
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC | Agilent Technologies | G2198-90001 | Liquid chromatography |
Disposable syringes | Chengdu Keen experimental equipment | / | 1ml |
EP tube | Chengdu Keen experimental equipment | / | 3ml |
Liquid phase injection bottle | Chengdu Keen experimental equipment | / | 1.5ml |
LTQ XL Mass Spectrometer | Thermo Fisher | LTQ21991 | Mass Spectrometer |
Microporous membranes | Chengdu Keen experimental equipment | / | 0.22μm |
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mm | Welch | 00201-31015 | Reversed-phase column |
Ultrasonic Cleaner | GT Sonic | UGT20DEC048Y | Ultrasonic Cleaner 240W 40KHz |
XAmide,3 μm,100A | Dalian Mondi Technology | D2019110601 | Hydrophilic column |