Summary

Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Published: January 19, 2024
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Abstract

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des Zellstoffwechsels bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die physiologische ROS-Produktion spielt eine zentrale Rolle bei der räumlichen und zeitlichen Modulation normaler zellulärer Funktionen wie Proliferation, Signalübertragung, Apoptose und Seneszenz. Im Gegensatz dazu ist eine chronische ROS-Überproduktion für ein breites Spektrum von Krankheiten verantwortlich, wie unter anderem Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes. Die genaue und reproduzierbare Quantifizierung des ROS-Spiegels ist daher für das Verständnis der normalen zellulären Funktionalität unerlässlich. Fluoreszenzbildgebungsbasierte Methoden zur Charakterisierung intrazellulärer ROS-Spezies sind ein gängiger Ansatz. Viele der bildgebenden ROS-Protokolle in der Literatur verwenden 2′-7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA)-Farbstoff. Dieser Farbstoff leidet jedoch unter erheblichen Einschränkungen in seiner Verwendung und Interpretierbarkeit. Das aktuelle Protokoll demonstriert die Verwendung einer Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzsonde als alternative Methode zur Quantifizierung der gesamten ROS-Produktion in einer Hochdurchsatzumgebung. Die Hochdurchsatz-Bildgebungsplattform CX7 Cellomics wurde verwendet, um die ROS-Produktion zu messen und zu quantifizieren. Diese Studie wurde an drei hepatozellulären Krebszelllinien durchgeführt – HepG2, JHH4 und HUH-7. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen Verfahren, die an der Bewertung von ROS in den Zellen beteiligt sind, einschließlich – Herstellung der DHE-Lösung, Inkubation der Zellen mit DHE-Lösung und Messung der DHE-Intensität, die zur Charakterisierung der ROS-Produktion erforderlich ist. Dieses Protokoll zeigt, dass DHE-Fluoreszenzfarbstoff eine robuste und reproduzierbare Wahl ist, um die intrazelluläre ROS-Produktion im Hochdurchsatz zu charakterisieren. Hochdurchsatzansätze zur Messung der ROS-Produktion sind wahrscheinlich in einer Vielzahl von Studien hilfreich, z. B. in der Toxikologie, beim Wirkstoffscreening und in der Krebsbiologie.

Introduction

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind eine Gruppe natürlich vorkommender, hochreaktiver und zeitlich instabiler chemischer Radikale, die als Teil des normalen Zellstoffwechsels in Zellen gebildet werden. ROS spielt eine wichtige und wesentliche Rolle bei der Modulation normaler physiologischer und biochemischer Prozesse, die in Zellen ablaufen 1,2. Die Hauptquelle der ROS-Produktion in Zellen ist der mitochondriale Elektronentransportkettenweg (ETC) als Teil des normalen bioenergetischen Zyklus. Zu den bedeutenden zusätzlichen Quellen der ROS-Produktion gehören enzymatische Reaktionen wie zelluläre NADPH-Oxidasen in Zellen. Der Stoffwechsel von Nahrungsmolekülen (z. B. Glukose) erfolgt über den oxidativen Phosphorylierungsweg in der mitochondrialen Matrix. Ein Ausgangsniveau der ROS-Produktion ist wichtig, um normale physiologische Zellsignalprozesse zu regulieren. Es ist bekannt, dass viele wichtige Proteinmoleküle, die Teil der metabolischen Glukosesignalwege sind (z. B. Akt und PTEN), auf intrazelluläre ROS-Spiegel reagieren. Darüber hinaus werden ROS von verschiedenen intrazellulären Enzymen wie Xanthinoxidase, Stickstoffmonoxidsynthase und peroxisomalen Bestandteilen als Teil der zellulären enzymatischen Signalwegeproduziert 1,2. Im Gegensatz zu den natürlichen Quellen von ROS führen bestimmte Umweltfaktoren wie Xenobiotika, Infektionserreger, UV-Licht, Umweltverschmutzung, Zigarettenrauchen und Strahlung ebenfalls zu einer übermäßigen Produktion von ROS, die ein Haupttreiber für intrazellulären oxidativen Stress sind 1,3. Erhöhter zellulärer oxidativer Stress kann native Biomoleküle in einer Zelle wie Lipide, Proteine und DNA schädigen und verschiedene Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, chronische Entzündungen und neurodegenerative Erkrankungen verursachen 1,3,4. Daher sind genaue Messungen von ROS unerlässlich, um die zellulären Mechanismen zu verstehen, die an der Pathophysiologie oxidativer Stress-induzierter Krankheiten beteiligt sind.

Aufgrund der kurzen Zeitskalen der ROS-Produktion und -Eliminierung in Zellen bleibt die quantitative Messung verschiedener ROS-Radikale eine Herausforderung. Methoden wie die paramagnetische Elektronenresonanz (EPR)5, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und die auf Fluoreszenzsonden basierende Bildgebung werden verwendet, um die verschiedenen zellulären ROS6 zu messen. Während Methoden wie EPR und HPLC quantitativ genaue Schätzungen liefern, beinhalten diese Methoden die Zerstörung der zellulären räumlichen Morphologie und erfolgen in der Regel in Form von Global- und Massenmessungen einer Probe. Im Gegensatz dazu behalten bildgebende Methoden wie Fluoreszenzsonden-basierte Methoden die zelluläre Morphologie und den räumlichen Kontext der ROS-Generation bei. Die Spezifität verschiedener Fluoreszenzsonden für verschiedene Arten von ROS-Radikalen ist jedoch nicht gut belegt 7,8. Mehrere Fluoreszenzsonden wie Dihydroethidium (DHE), Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), Dihydrorhodamin (DHR), Dimethylanthracen (DMA), 2,7-Dichlordihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) und MitoSox sind für den ROS-Nachweis kommerziell erhältlich. In den letzten Jahrzehnten waren DHE, MitoSox und DCFH-DA die am häufigsten verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zur Messung von ROS in Zellen und Geweben 8,9. DCFH-DA ist ein weit verbreiteter Farbstoff zum Nachweis von intrazellulärem H2O2 und oxidativem Stress. Trotz der Popularität von DCFH-DA haben mehrere frühere Studien gezeigt, dass es nicht zuverlässig zur Messung der intrazellulären H2O2 und anderer ROS-Spiegel verwendet werden kann 8,9,10,11,12,13,14.

Im Gegensatz dazu zeigt die Fluoreszenzsonde Dihydroethidium (DHE) eine spezifische Reaktion auf das intrazelluläre Superoxidradikal (O2). Während das Superoxidradikal eine von vielen der in Zellen beobachteten ROS-Spezies ist, ist es ein wichtiges Radikal, das unter anderem an der Reduktion von Übergangsmetallen, der Umwandlung in Peroxynitrat und der Bildung von Hydroperoxiden beteiligt ist. DHE wird schnell von den Zellen aufgenommen und hat eine Fluoreszenzemission im roten Wellenlängenbereich15. Bei der spezifischen Reaktion mit Superoxidradikalen bildet DHE ein rot fluoreszierendes Produkt, 2-Hydroxyethidium (2-OH-E+). Daher kann DHE als spezifische Sonde für den Superoxidnachweis betrachtet werden. DHE kann jedoch auch eine unspezifische Oxidation mit ONOO oder OH, H2O 2 und Cytochrom c durchlaufen, um ein zweites Fluoreszenzprodukt, Ethidium E+, zu bilden, das die gemessenen 2-OH-E+-Spiegel stören kann. Diese 2-OH E+ und E+ Produkte stellen jedoch in Kombination einen großen Teil der gesamten zellulären ROS-Spezies dar, die in einer Zelle beobachtet werden, wenn sie mit DHE gefärbt werden. E+ interkaliert in die DNA und verstärkt deren Fluoreszenz 8,9,10,11,13,14,15,16. Da sich die Fluoreszenzspektren von Ethidium und 2-Hydroxyethidium nur geringfügig unterscheiden, kann der Großteil der ROS-Werte, die in einer Zelle infolge der Superoxidproduktion beobachtet werden, mit DHE-Fluoreszenzprodukten nachgewiesen und gemessen werden. Diese ROS-Spezies werden mit einer Wellenlängenanregung von 480 nm und einer Wellenlängenemission von 610 nm 15,16,17 identifiziert.

Neben der Auswahl einer spezifischen fluoreszierenden ROS-Detektionssonde ist es wichtig, eine empfindliche Nachweismethode zur Messung intrazellulärer ROS zu wählen. Die genaue Beurteilung der intrazellulären ROS-Spiegel ist daher der Schlüssel zur Identifizierung gestörter Redox-Gleichgewichtszustände, die in erkrankten Zellen oder Zellen auftreten, die verschiedenen Umweltstressoren wie Strahlung, toxikologischen Verbindungen und genotoxischen Wirkstoffen ausgesetzt waren18. Da ROS ein häufig auftretendes Phänomen in Zellen ist, das für die Regulierung einer Vielzahl von Zellsignalaktivitäten verantwortlich ist, sind robuste Methoden zum Nachweis von ROS unerlässlich. Um eine solche Hochdurchsatzbewertung der ROS-Produktion innerhalb von Zellen zu ermöglichen, verwendet dieses Protokoll eine High-Content-Screening-Plattform (HCS) zur Messung der ROS-Spezies. Das aktuelle Protokoll ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse der intrazellulären ROS-Produktion, die in vielen toxikologischen Studien von entscheidender Bedeutung ist19. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine einfache und vielseitige Lösung zum Nachweis und zur Messung intrazellulärer ROS in adhärenten hepatozellulären Karzinomzellen bereitzustellen. Die chemischen Reagenzien von H2O2 und Menadion werden als potente ROS-Stimulatoren verwendet, um die relativen Niveaus der ROS-Produktion in einer kontrollierten und hohen Durchsatzeinstellung zu messen. Dieses Protokoll kann bei Bedarf fein abgestimmt werden, um die ROS-Produktion in adhärenten und nicht adhärenten Zellen unter geeigneten Bedingungen zu messen.

Protocol

1. Zellkultur Aussaat der Testzellen (hepatozelluläre HepG2-, HUH7- und JHH4-Karzinomzellen) in eine 96-Well-Platte mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen/Well in einem endgültigen Aussaatvolumen von 200 μl pro Well.Vor der Kultivierung der HepG2-Zellen beschichten Sie die 96 Plattenvertiefungen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) mit Kollagen Typ IV (50 μg/ml). Um eine Verfestigung des Stammkollagens zu vermeiden, geben Sie die Stammlösung in Eis und leiten Sie anschließend den Verdünnungsprozess auf die gewünschte Konzentration ein. Nach einer 2-stündigen Inkubationszeit das überschüssige Kollagen absaugen und die Vertiefungen dreimal mit dem 1x PBS waschen. Kultivieren Sie die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 -Konzentration in einem befeuchteten Inkubator. Behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag oder bei Erreichen der Konfluenz von 80 % bis 90 %, je nachdem, was früher eintritt, mit H2O2 (unbehandelt, 250 μM, 500 μM, 750 μM und 1000 μM) bzw. Menadion (unbehandelt, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), um den repräsentativen oxidativen Stress zu induzieren. Alternativ können Sie die Zellen mit der gewünschten Testsubstanz Ihrer Wahl testen, die oxidativen Stress in den Zellen induzieren kann. 2. Vorbereitung der Stamm- und Verdünnungslösung für die DHE-Färbung von Zellen Bereiten Sie DHE-Stammlösung (5 mg/ml oder 15,9 mM) vor, indem Sie 5 mg DHE in 1 ml DMSO auflösen. Verdünnen Sie die DHE-Stammlösung mit doppelt destilliertem autoklaviertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 μM. Um den Gefrier- und Auftauprozess des Farbstoffs zu vermeiden (der die Fluoreszenzeigenschaften im Laufe der Zeit beeinträchtigen kann), bereiten Sie mehrere Aliquots in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit einer Konzentration von 100 μM vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Um eine endgültige Arbeitskonzentration von 10 μM zu erreichen, verwenden Sie ein Aliquot der 100 μM DHE-Konzentration und verdünnen Sie es mit vorgewärmten DMEM-Medien.HINWEIS: Die Arbeitslösung muss am Tag des Versuchs frisch zubereitet werden. Wirbeln Sie die Arbeitsfluoreszenzfarbstofflösung 5-10 s lang ein, um eine ordnungsgemäße Mischung des Farbstoffs zu gewährleisten. 3. DHE-Färbeprozess Entfernen Sie das wirkstoff- oder testsubstanzhaltige Medium aus jeder Vertiefung und waschen Sie es einmal vorsichtig mit entweder 1x PBS oder DMEM.HINWEIS: Bei der Durchführung der Additions- oder Waschschritte im Experiment ist es wichtig, den direkten Kontakt zwischen den Zellen und der Pipette zu vermeiden. Dies kann erreicht werden, indem das PBS vorsichtig an den Seiten der Wells pipettiert wird, um mögliche mechanische Schäden an den Zellen zu minimieren. Wenn Sie sicherstellen, dass die Pipette die Zellen nicht direkt berührt, wird die Integrität und Lebensfähigkeit der Zellen für die Dauer des Experiments erhalten. Geben Sie 100 μl DMEM-Medien mit 10 μM DHE (Arbeitslösung) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C. Entfernen Sie nach 30 Minuten Inkubationszeit das DHE-haltige Medium und waschen Sie jede Vertiefung dreimal vorsichtig mit der 1x phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS). Dies kann mit einer Mehrkanalpipette durchgeführt werden, um einen schnellen Durchlauf zu gewährleisten. 200 μl 1x PBS in jede Vertiefung mit Hoechst 33342 Kernfärbefarbstoff für 10 min bei RT geben. Entfernen Sie die Hoechst 33342 Kernfärbelösung aus der Vertiefung und geben Sie 200 μl 1x PBS in jede Vertiefung.HINWEIS: Um fixierte Zellen zu erhalten, befolgen Sie das gleiche Protokoll wie für die lebenden Zellen, mit einem zusätzlichen Schritt der Zugabe von 4% PFA für 5 Minuten nach der Behandlung und DHE-Färbung. Entfernen Sie die PFA-Lösung und waschen Sie die Zellen mit dem 1x PBS. Inkubieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang mit dem Kernfärbefarbstoff. Bringen Sie die Platte so schnell wie möglich zur High-Content-Screening-Plattform, Fluoreszenzmikroskopie oder zum Plattenleser für die Bildaufnahme. 4. Bildaufnahme und Intensitätsmessung Laden von PlattenÖffnen Sie die Cellomics CX7 High-Content-Screening-Software (HCS) für die Datenerfassung. Kalibrieren Sie die Bildgebungsplattform im Voraus sorgfältig gemäß den Spezifikationen des Herstellers mit der spezifischen 96-Well-Platte Ihrer Wahl, um verschwommene oder verschwommene Bilder in den Daten zu vermeiden.HINWEIS: Multi-Well-Platten verschiedener Anbieter können unterschiedliche Materialeigenschaften aufweisen und die Qualität der endgültigen Bilder beeinflussen. Speichern Sie nach der Kalibrierung die für die Plattenmarke spezifischen Systemparameter in der Gerätedatenbank und verwenden Sie sie für zukünftige Datenerfassungen wieder. Legen Sie die Platte mit den vorbereiteten Proben vorsichtig auf den beheizten Tisch des HCS-Bildgebungssystems. Stellen Sie sicher, dass die Platte sicher positioniert und in der richtigen Ausrichtung für die Bildgebung auf dem Mikroplattenhalter ist (d. h. suchen Sie das mit A1 gekennzeichnete Etikett auf dem Reader-Tisch und drehen Sie dann die Mikroplatte so, dass die Position der Vertiefung A1 mit der Ecke des Aufklebers übereinstimmt). Drücken Sie vorsichtig auf die Mikroplatte, um sicherzustellen, dass sie flach auf dem Tisch anliegt. Eine ungleichmäßige Nivellierung der Platte im HCS-System kann zu Fehlern bei der Bildaufnahme führen. Nachdem die Platte eingesetzt ist, halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie dann im Dialogfeld Platten laden/entladen in der Software auf Strg-OK . Auswählen von BildgebungsparameternÖffnen Sie im HCS-Bildgebungssystem den Target-Aktivierungsmodus in der Cellomics-Bioanwendungsoberfläche und erstellen Sie ein neues Protokoll mit dem Zweikanal-Setup-Protokoll, das mit (a) Kernfärbung und (b) DHE-Fluoreszenzsondendatenerfassung kompatibel ist. Im aktuellen Protokoll wurden die Filter 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS und 386_BGS_RS für (a) die Nuklearfärbung von Hoechst 33342, (b) die gesamte ROS-Produktion bzw. (c) die Erkennung von Superoxidradikalen verwendet. Die Wahl dieser Filter wurde durch die spezifische Überlappung der Emissionseigenschaften der einzelnen Farbstoffe (DAPI und DHE) bestimmt, die als Teil dieses Protokolls verwendet werden.HINWEIS: Die Namenskonvention von Filtern, z. B. 386-23_BGRFRN_BGRFRN, bezieht sich auf die Anregung der Probe mit 386-nm-Licht mit einer Bandbreite von 23 nm, gefolgt von einem dichroitischen Filter, der blaues (B), grünes (G), rotes (R), dunkelrotes (FR) und nahes Infrarotlicht (N) in bestimmten Wellenlängenbereichen durchlässt, und das 386_BGS_RS bezieht sich auf einen Emissionsfilter, der BGS- und RS-Emissionswellenlängenlicht nach dem dichroitischen Licht durchlässt. Geben Sie die Objektive für den Bildaufnahmeprozess innerhalb der Softwareprotokollschnittstelle an, z. B. 10-fache oder 20-fache Vergrößerung, falls erforderlich. Wählen Sie die geeignete Objektivvergrößerung in Abhängigkeit von der gewünschten Detailgenauigkeit der Bildgebung und den für das Experiment erforderlichen Auflösungen. Die Auflösung jedes Ziels ist jedoch festgelegt. Details mit höherer Auflösung erfordern einen Austausch des Ziels auf der Plattform. Im aktuellen Protokoll wird ein 20x-Objektiv mit 0,45 NA verwendet, das Teil der in diesem Protokoll verwendeten High-Content-Screening-Plattform ist.HINWEIS: Das 20x-Objektiv stellt einen guten Kompromiss zwischen der Detailgenauigkeit der Bildauflösung und der Erfassungsgeschwindigkeit dar, die erforderlich ist, um ROS-Änderungen im Laufe der Zeit zu erfassen. Objektive mit höherer Vergrößerung können gewählt werden (z. B. 40X), dies führt jedoch zu längeren Aufnahmezeiten. Legen Sie die Belichtungseinstellungen der Bildaufnahmekamera fest, z. B. die Belichtungszeit, das Kamera-Binning und das Z-Stapel-Intervall, entsprechend den spezifischen Anforderungen des Protokolls.HINWEIS: Die Belichtungszeit (oft in Millisekunden) variiert je nach Signalstärke und Empfindlichkeit der verwendeten spezifischen Fluorophore. Dies kann sich auch von Experiment zu Experiment leicht unterscheiden, basierend auf der Farbstoffkonzentration und der Färbequalität. Im aktuellen Protokoll sind die Erfassungsparameter wie folgt festgelegt: Ziel % – 35%, Bildaufnahmemodus – 1104 x 1104 (mit 2×2-Binning) und Objektiv 20x, 0,45 NA. Diese Parameter können entsprechend den spezifischen Versuchsbedingungen eingestellt werden. Konfigurationsparameter für die BildgebungHINWEIS: Sobald die Bildparameter eingestellt sind, kann der Bilderfassungsprozess über die Softwareschnittstelle gestartet werden.Parameter für die BildsammlungIdentifizieren Sie das primäre Tracking-Objekt von Interesse (den Zellkern) mit verschiedenen im Gerät verfügbaren Algorithmen (Optik – Isodaten, fest und Dreieck).HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Isodata-Methode zur Identifizierung und Kennzeichnung des Primärobjekts verwendet. Segmentieren Sie das Objekt (falls vorhanden) entweder nach Form oder Intensitätsparameter. Überprüfen Sie das primäre Objekt basierend auf den gewünschten Größen-, Form- und Intensitätsparametern, die für jeden Zellentyp eindeutig sind. Definieren Sie dann den “Bereich of Interest” (ROI) um dieses primäre Objekt.HINWEIS: Der ROI ist ein Schlüsselparameter der Datenerfassung, der den Ort definiert, an dem die Intensität des Fluoreszenzfarbstoffs als konsistent und wiederholbar über alle Zelltypen hinweg identifiziert wird. Der ROI definiert die wichtigsten Parameter (z. B. die Intensität des Farbstoffs), die für jedes primäre Tracking-Objekt (d. h. eine Zelle) in verschiedenen Kanälen des Geräts gemessen werden. Der ROI kann in Form eines Kreises oder Rings um den Kern jeder Zelle definiert werden. Die HCS-Software ermittelt automatisch die Intensität des DHE-Fluoreszenzfarbstoffmarkers in Kanal 2 innerhalb der Grenzen des ROI für jede Zelle, die segmentiert und automatisiert analysiert wird. Stellen Sie einen 20 μm großen Kreis um das Primärobjekt (Kern) ein. Der Abstand von 20 μm wurde in dieser Studie basierend auf den ungefähren Größen der verschiedenen in diesem Protokoll verwendeten Zelllinien (HepG2, JHH-4 und HUH-7) gewählt. Der 20-μm-Ring-ROI um die Zellen erhielt die Fluoreszenzintensität auf konsistente und wiederholbare Weise.HINWEIS Der Schlüsselparameter bei der Auswahl eines ROI ist die Fähigkeit, die Zellenfläche angemessen abzudecken. Die Größe des kreisförmigen ROI hängt von der Zellengröße ab. Größere Zellen erfordern möglicherweise einen höheren ROI und umgekehrt einen geringeren ROI. Diese Parameter müssen im Voraus für jeden Zelltyp und Fluoreszenzfarbstoff von Interesse bestimmt werden. Charakterisierung der Population und Auswahl der zu speichernden MerkmaleSobald die verschiedenen Erfassungsparameter im HCS-Bildgebungsprotokoll definiert sind, versetzen Sie das HCS-System in den Datenerfassungsmodus. Die Bildaufnahmeparameter für dieses Protokoll wurden wie folgt festgelegt: ein Scan-Limit von 1000 Zellen/Well, mit einer Mindestanforderung von 10 Objekten (Zellen) pro Feld.HINWEIS: Die Anzahl der für jedes Well bewerteten Felder wurde basierend auf der endgültigen Zellzahl bestimmt, die die Zahl 1000 erreicht. Das HCS-System durchsucht weiterhin verschiedene Stellen innerhalb des Wells, bis es die Zielpopulation von 1000 Zellen/Well erhält. Die Erfassungsgeschwindigkeit hängt daher von der Konfluenz und der Gesamtzahl der in jedem Well der 96-Well-Platte vorhandenen Zellzahlen ab. Im aktuellen Protokoll wurden die Gesamt- und Durchschnittsintensität von Kanal 2 (der die Superoxidradikale und die gesamte ROS-Produktion darstellt) aus jedem Bohrloch für weitere nachgelagerte Analysen gesammelt. Bilderfassung, -verarbeitung und -analyseNachdem Sie die Bildaufnahmeparameter angepasst und abgeschlossen haben, starten Sie den Scanvorgang für jede 96-Well-Platte.HINWEIS: Das Cellomics CX7-Bildgebungssystem ermöglicht ein High-Content-Screening und eine automatisierte Analyse von Proben mit einer Vielzahl von Parametern, einschließlich der ROS-Produktion innerhalb von Zellen mit hohem Durchsatz. Zusätzlich zur ROS-Produktion ist das HCS-System in der Lage, zusätzliche wertvolle Informationen über verschiedene Parameter wie Zellmorphologie, subzelluläre Lokalisierung und viele andere zelluläre Merkmale von Interesse zu liefern. Einmal für die Erfassung optimiert, ermöglicht die HCS-Bildgebungsplattform eine umfassende, qualitative und quantitative Charakterisierung von Zellparametern auf robuste Weise. Starten Sie nach Abschluss des Scanvorgangs die View Analysis-Software und exportieren Sie die verschiedenen quantitativen Datenparameter in einem .csv Format für weitere Analysen. Kopieren Sie mit Software von Drittanbietern die verschiedenen quantitativen Werte, die für weitere nachgelagerte Analysen von Interesse sind, und fügen Sie sie ein.HINWEIS: Im aktuellen Protokoll wurde die GraphPad Prism-Software verwendet, um die DHE-Intensitätswerte als Reaktion auf induzierten oxidativen Stress aufgrund von H2O2 – und Menadion-Expositionen zu analysieren. Daten und statistische AnalysenBerechnen Sie die mittlere durchschnittliche Intensität von Kanal 2 (die die gesamten ROS-Werte und Superoxidradikale darstellt).HINWEIS: Alle Experimente zur Berechnung der Intensitätswerte wurden dreimal mit 6 Wiederholungen pro Bedingung bei jeder Dosierungsstufe wiederholt. Führen Sie eine Einweg-ANOVA oder einen t-Test durch, um die Unterschiede in den Intensitätswerten zwischen verschiedenen Testbedingungen zu messen.

Representative Results

Dihydroethidium (DHE) ist ein auf Superoxid reagierender Fluoreszenzfarbstoff, der spezifische Informationen über die intrazellulären ROS-Zustände liefert. DHE-Farbstoff emittiert intrinsisch blaue Fluoreszenz im Zytoplasma. Bei Wechselwirkung mit Superoxidradikalen wird es jedoch in 2-Hydroxyethidium umgewandelt, das Fluoreszenz in den roten Wellenlängen (>550 nm) emittiert (Abbildung 1). DHE-Farbstoff wird leicht in die Zellen und den Zellkern transportiert. Die emittierte Fluoreszenz …

Discussion

In dieser Studie wurde ein Protokoll zur Bewertung der superoxidgesteuerten intrazellulären Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff auf einem High-Content-Screening-System erstellt. Ein Großteil der derzeit in der Literatur verfügbaren Protokolle verwendet die DCFH-DA als Fluoreszenz-Bildgebungssonde zur Quantifizierung von ROS-Spezies. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass die DCFH-DA keine ideale Sonde für die Messung intrazellulärer ROS…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RK und RRG wurden durch einen Zuschuss des UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) durch den NIH NIGMS-Zuschuss P20 GM130422 unterstützt. RRG wurde durch einen Pilotpreis aus dem NM-INSPIRES P30-Stipendium 1P30ES032755 unterstützt. Die Unterstützung des Bildgebungskerns für das CX7 Cellomics-Instrument wurde durch die AIM-Center-Kerne bereitgestellt, die durch NIH-Zuschüsse P20GM121176 finanziert wurden. Wir danken Dr. Sharina Desai und Dr. Li Chen für ihre unschätzbare Unterstützung bei technischen Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung der CX7 Cellomics-Bildgebungsplattform.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes  VWR  20170-038 
96- well plate  Corning Costar  07-200-90 
Cellomics Cx7 ThermoFisher  HCSDCX7LEDPRO
Collagen  Advanced Biomatrix   5056 
DHE (Dihydroethidium)  ThermoFisher  D1168 
DMEM  Sigma   6046 
FBS  VWR  97068-085 
GraphPad Prism GraphPad Version 6.0
HepG2 cell line ATCC
Hoechst  ThermoFisher  33342 
HUH7 cell line ATCC
Hydrogen Peroxide  Sigma  88597 
JHH4 cell line ATCC
Menadione  Sigma  M5625 

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Kumar, R., Gullapalli, R. R. High Throughput Screening Assessment of Reactive Oxygen Species (ROS) Generation using Dihydroethidium (DHE) Fluorescence Dye. J. Vis. Exp. (203), e66238, doi:10.3791/66238 (2024).

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