환경적으로 획득한 혐기성 미생물을 배양하기 위한 In Situ Informed Simulated Medium 형식 세트
Summary
이 논문의 초점은 환경에서 획득한 까다로운 혐기성 미생물을 위한 배지를 만들기 위한 모범 사례를 자세히 설명하는 것입니다. 이러한 방법은 혐기성 배양을 관리하는 데 도움이 되며 찾기 어려운 배양되지 않은 미생물인 “미생물 암흑 물질”의 성장을 지원하는 데 적용할 수 있습니다.
Abstract
혐기성 미생물의 배양 의존적 연구는 방법론적 역량에 달려 있습니다. 이러한 분석법은 혐기성 미생물에 적합한 성장 조건(예: pH 및 탄소원)을 만들고 유지하는 동시에 인공 환경을 손상시키지 않고 샘플을 추출할 수 있어야 합니다. 이를 위해 현장 환경에 의해 정보를 얻고 시뮬레이션하는 방법은 해당 환경에서 미생물을 배양하는 데 큰 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 지상 표면 및 지하 미생물을 배양하기 위한 현장 정보 및 시뮬레이션 혐기성 방법을 간략하게 설명하고 교란을 최소화한 혐기성 샘플 수집을 강조합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 혐기성 액체 배지의 생산과 혐기성 미생물의 환경 획득 및 시험관 내 성장에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 환경적으로 획득한 배양을 위한 퇴적물 및 혐기성 액체 매체의 환경 시뮬레이션에 사용되는 혐기성 생물반응기의 중요한 구성 요소를 다룹니다. 우리는 실험적 탄소원에 반응하여 활성 배양이 동적으로 조정되는 생물반응기의 수명 동안 유지된 마이크로바이옴의 예비 차세대 염기서열 분석 데이터를 포함했습니다.
Introduction
대부분의 미생물은 배양되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이것은 한천 플레이트를 사용하여 성공적으로 배양된 소수의 미생물과 대조되는 현미경을 통해 관찰된 세포 간의 큰 불균형에 의해 뒷받침됩니다. 스탈리(Staley)와 코놉카(Konopka)는 이 차이를 “판금 카운트 변칙(Great Plate Count Anomaly)”이라고 명명했다.[1] 추정된 설명되지 않은 다양성은 여러 다른 환경에서 순위 풍부도 곡선에 분포된 많은 새로운 속을 보여주는 메타게놈 및 메타전사체 데이터에 의해 뒷받침된다2. 관찰되었지만(일반적으로 미생물 군집의 무작위 샷건 시퀀싱에 의해) 배양되지 않은 미생물은 “미생물 암흑물질”(microbial dark matter)이라고 불립니다.3,4.
-omics의 시대에 미생물 배양은 게놈 데이터를 완전히 평가하고 존재하는 유전자의 기능/표현형을 검증하는 데 필수적입니다. 배양된 미생물의 염기서열 분석은 샷건 균유전체학(shotgun metagenomics) 및 환경으로부터 메타게놈 조립 게놈(metagenome-assembled genomes)과 같은 기술이 허용될 때까지 완전한 게놈을 자신 있게 얻을 수 있는 유일한 방법이다5. 배양된 미생물과 결합된 게놈 평가는 “미생물 암흑 물질”을 이해하기 위한 강력한 추론을 제공합니다. “미생물 암흑 물질”의 많은 구성원은 영양소 및 기타 원소의 순환과 귀중한 천연 제품의 생산에 영향을 미치고 생태계를 지원하며 생태 서비스를 수행하는 중요한 기능을 수행합니다. 의학적 관점에서 볼 때, 현재 판매되고 있는 모든 의약품의 약 절반은 박테리아 제품 및 제품의 파생물이며, 배양되지 않은 종을 프로파일링하면 미래의 항생제를 밝힐 수 있을 것으로 의심됩니다. 이 비교양 다수에게 접근하기 위해서는 다양한 재배 방법론을 늘려야 한다6. “미생물 암흑물질(microbial dark matter)”의 구성원 중 혐기성 과소영양 미생물은 대체로 과소 보고되고 있으며, 생태학적으로나 산업적으로 가치 있는 생화학적 경로7를 보유하고 있을 가능성이 높기 때문에 배양의 중요한 표적이 된다. 그러나 혐기성 과소 영양 미생물은 종종 더 긴 배양 시간이 필요하고, 까다로운 조건(예: 특정 비표준 체외 온도) 및 특수 배지 레시피의 사용으로 인해 호기성 및 코피오영양 미생물보다 배양하기가 더 어렵습니다.
새로운 혐기성 과소 영양 미생물을 포함하여 “미생물 암흑 물질”의 구성원을 배양하기 위한 현재 개발 기술은 우리의 이해를 크게 향상시키고 계통 발생 나무 내에서 이러한 미생물의 표현을 증가시켰습니다. 새로운 미생물을 배양하기 위해 정보에 입각한 배지를 사용하는 현재 기술(즉, 관심 미생물에 대한 지식을 사용하여 유도된 배지)은 세 가지 뚜렷한 방법으로 구분할 수 있습니다. 첫 번째 방법은 멤브레인 내에 이미 관심 미생물을 포함하는 시험관 내 성장 챔버로 전달하기 위해 환경의 개별 부분을 직접 제거하는 것입니다. 개별 섹션(예: 해수)은 관심 미생물이 현장에서 사용하는 지구화학적 서식지를 제공하는 역할을 하는 반면, 멤브레인은 세포의 이동을 억제합니다(관심 세포는 내부에 남아 있고 개별 섹션과 함께 도착한 외부 세포는 남아 있지 않음). 자연 서식지에서 미생물을 표적으로 하는 데 자연적으로 이용 가능한 화합물을 포함시킴으로써, 이러한 미생물을 배양할 수 있다8. 두 번째 방법은 메타전사체학 또는 유전체학을 활용하여 대사 능력을 규명하여 표적 배지 설계에 대한 배양 매개변수를 좁힐 수 있는 단서를 제공합니다. 이 접근법은 환경에서 특정 유형의 미생물을 풍부하게 하는 데 사용할 수 있는 생태생리학적 프로필을 제공합니다. 배지의 조항은 농축 다양성을 감소시키기 위해 표적 미생물을 지원하는 것으로 추정되는 존재하는 확인된 유전자에 맞춰져 있습니다.9,10. 한 가지 주의할 점은 게놈 정보는 유전자의 발현을 직접 추론하지 않는 반면, 전사체 정보는 유전자의 발현을 직접 추론한다는 것입니다.
세 번째 방법은 미디어를 시뮬레이션하지 않고 환경을 미디어 소스로 직접 사용하는 첫 번째 방법과 달리 환경 정보에 입각한 시뮬레이션된 미디어를 포함합니다. 이 세 번째 방법은 관심 미생물이 포함된 현장 현장의 지구화학에 대한 환경 정찰이 필요합니다. 이러한 지식을 바탕으로 기본 구성 요소와 물리적 매개변수를 식별하여 환경에 입각한 시뮬레이션 매체를 생성합니다. 그런 다음 배지는 환경에서 미생물 함유 침전물 또는 액체를 배지로 직접 주입합니다. 이 방법은 배양 미생물학자가 충분한 양의 소스 환경(첫 번째 방법에 필요함) 또는 적절한 메타전사체 또는 게놈 데이터(두 번째 방법에 필요한 경우)에 액세스할 수 없는 경우에 특히 유용합니다.
다음 프로토콜은 세 번째 방법의 예입니다. 관심 있는 환경을 시뮬레이션하는 것을 목표로 합니다. 현장에서 획득한 다양한 혐기성 미생물 배양을 표적으로 하는 세 가지 순진한 배지 레시피가 프로토콜 내에서 병렬로 제시됩니다. 대표되는 3가지 배양물은 토양에서 유래한 혼합배양(이하, 토양 혼합 배양), 시추공 내에서 유래한 혼합 배양(이하, 시추공 혼합 배양), 시추공 내에서 유래한 분리 메탄겐(이하, 시추공 분리 메탄원)이다. 여기에 공유된 미디어 레시피의 복합 정체성과 양은 시작 가이드로 사용됩니다. 그들은 독자의 환경과 관심 미생물에 맞게 맞춤화할 수 있고 권장됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 중간 생산 섹션(섹션 1)은 출판 이후 널리 사용되어 온 Miller and Wolin17의 수정된 Hungate 기법에 그 구조를 빚지고 있습니다. 이 확장된 프로토콜의 실용성은 서술적 특성과 미생물의 현장 획득과의 결합에서 비롯됩니다. 환경에 대한 정보를 제공하고 시뮬레이션된 배지를 포함하는 배양병은 혐기성 지하 박테리아 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 균주 DRI13<sup cl…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 수년에 걸쳐 이러한 기술에 영향을 미치거나 발전시킨 정보와 멘토링의 계보를 인정하고 싶습니다. 전직 대학원생, 박사 후 연구원 및 현재 교수인 Hamilton-Brehm 박사는 시간을 내어 혐기성 기술을 가르친 Mike Adams 박사, Gerti Schut 박사, Jim Elkins 박사, Mircea Podar 박사, Duane Moser 박사 및 Brian Hedlund 박사에게 감사의 빚을 지고 있습니다. 국제자연보호협회(Nature Conservancy)와 아메리칸 리버스(American Rivers)는 각각 G21-026-CON-P 보조금과 AR-CE21GOS373 보조금을 통해 이 작업을 지원했습니다. 이 논문에 표현된 모든 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 Nature Conservancy 또는 American Rivers의 견해를 반영하는 것은 아닙니다. 이 연구는 SIU Advanced Energy Institute의 보조금으로 지원되었으며, SIU Advanced Energy Institute는 Advanced Energy Resource Board를 통해 수여된 자금 지원에 감사를 표합니다. NGS는 LC Sciences에서 수행했습니다.
Materials
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" – 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
Referenzen
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the’omics’ age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- . Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013)
- . Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512 Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018)
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).
