Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.
Die Entwicklung synthetischer Biomarker für die Entwicklung von Präzisionsdiagnostika hat die Erkennung von Krankheiten über Wege ermöglicht, die über die für herkömmliche Biofluidmessungen verwendeten hinausgehen. Synthetische Biomarker verwenden im Allgemeinen Reporter, die lesbare Signale in der Bioflüssigkeit liefern, um die biochemischen Veränderungen in der lokalen Krankheitsmikroumgebung während des Auftretens und Fortschreitens der Krankheit widerzuspiegeln. Die pharmakokinetische Konzentration der Reporter und die biochemische Amplifikation des Krankheitssignals sind von größter Bedeutung, um eine hohe Sensitivität und Spezifität in einem diagnostischen Test zu erreichen. Hier wird eine Krebsdiagnoseplattform mit einem Format synthetischer Biomarker aufgebaut: aktivitätsbasierte Nanosensoren, die chemisch stabilisierte DNA-Reporter tragen, die durch aberrante proteolytische Signaturen in der Tumormikroumgebung freigesetzt werden können. Synthetische DNA als Krankheitsreporter bietet Multiplexing-Fähigkeit durch ihre Verwendung als Barcode, die das gleichzeitige Auslesen mehrerer proteolytischer Signaturen ermöglicht. DNA-Reporter, die in den Urin freigesetzt werden, werden mit Hilfe von CRISPR-Nukleasen durch Hybridisierung mit CRISPR-RNAs nachgewiesen, die wiederum bei Enzymaktivierung ein fluoreszierendes oder kolorimetrisches Signal erzeugen. In diesem Protokoll werden DNA-Barcode-basierte, aktivitätsbasierte Nanosensoren konstruiert und ihre Anwendung in einem präklinischen Mausmodell für metastasierenden Darmkrebs veranschaulicht. Dieses System ist je nach Krankheitsbiologie in hohem Maße modifizierbar und erzeugt mehrere Krankheitssignale gleichzeitig, was ein umfassendes Verständnis der Krankheitsmerkmale durch einen minimalinvasiven Prozess ermöglicht, der nur die Verabreichung von Nanosensoren, die Urinsammlung und einen Papiertest erfordert, der eine Point-of-Care-Diagnostik ermöglicht.
Trotz der erheblichen Anstrengungen, Tumor-Biomarker wie abgestoßene Proteine und DNA zu identifizieren, wurde das Feld der Krebsdiagnostik durch ihre geringe Häufigkeit oder ihren schnellen Abbau im Kreislauf belastet1. Als ergänzende Strategie stellen biotechnologisch hergestellte synthetische Biomarker, die selektiv auf Krankheitsmerkmale reagieren, um verstärkte Signale zu erzeugen, neue Wege zu einer genauen und zugänglichen Diagnostik dar 2,3. Um die Erkennung zu unterstützen, nutzen diese synthetischen Biomarker tumorabhängige Aktivierungsmechanismen wie die enzymatische Amplifikation, um Analyten mit verbessertem Signal-Rausch-Verhältnisherzustellen 4. Hierbei wird eine Klasse von krebsassoziierten Enzymen, Proteasen, genutzt, um injizierbare nanoskalige Sensoren zu aktivieren, um Krankheitsreporter freizusetzen, die aus den Bioflüssigkeiten wie Blut oder Urin nachweisbar sind 5,6. Angesichts der Tumorheterogenität ermöglicht die Entwicklung eines Panels von Protease-aktivierten Sensoren Multianalyttests, die verschiedene Protease-Spaltungsereignisse zu einer “Krankheitssignatur” kombinieren, um die Krebsinzidenz und -progression auf spezifischere, multiplexe Weise zu bewerten.
Es wurden Protease-aktivierte synthetische Biomarker entwickelt, die Peptidsubstrate umfassen, die an die Oberfläche eines inerten Trägerskonjugiert sind 7. Wenn diese Peptide in vivo injiziert werden, werden sie zum Tumor transportiert, woraufhin die enzymatische Spaltung durch Tumorproteasen Reporter zum Nachweis in Blut oder Urin freisetzt. Der Multiplex-Nachweis mit Protease-aktivierten synthetischen Biomarkern erfordert, dass jeder synthetische Biomarker in einem Cocktail mit einem eindeutigen molekularen Barcode gekennzeichnet wird. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Ansätze entwickelt, darunter Massen-Barcodes und ligandenkodierte Reporter 8,9,10. Im Gegensatz zu diesen Multiplexing-Methoden, die auf wenige verschiedene Signalmöglichkeiten beschränkt sein können, bietet DNA-Barcoding viel mehr Kombinationen, die der hohen Komplexität und Heterogenität menschlicher Krankheitszustände entsprechen. Um die Multiplexität synthetischer Biomarker zu erweitern, werden die Sensoren mit einem Barcode versehen, indem jeder Reporter mit einer eindeutigen DNA-Sequenz markiert wird, die über die CRISPR-Cas-Nuklease nachgewiesen werden kann, um das biofluidische Signal ex vivo zu verstärken. Diese einzelsträngigen DNA-Barcodes (ssDNA) sind so konzipiert, dass sie an komplementäre CRISPR-Guide-RNAs (crRNAs) binden und die zielgesteuerte kollaterale Nukleaseaktivität von CRISPR-Cas12aaktivieren 11. Diese Nukleaseaktivität kann verwendet werden, um einen Reporter-DNA-Strang zu spalten, der durch Fluoreszenzkinetik oder unter Verwendung von Papierstreifen nachgewiesen wird.
Neben der molekularen Amplifikation über Proteasen (in vivo) und CRISPR-Cas (ex vivo) besteht ein weiteres wichtiges Designmerkmal von Protease-aktivierten synthetischen Biomarkern darin, die Pharmakokinetik von Nanomaterialien zu nutzen, um die diagnostische Signalkonzentration in Bioflüssigkeiten zu erhöhen10. Ein Ansatz ist die Verwendung eines Nanopartikelträgers, um die Zirkulationszeit von oberflächenkonjugierten Peptidsubstraten zu erhöhen. Ein Polyethylenglykol (PEG)-Dendrimer wird als Nanocarrier mit relativ kleinem hydrodynamischem Durchmesser und Multivalenz ausgewählt, um die Abgabe an Tumore zu erhöhen. Obwohl er klein genug ist, um die Tumorabgabe zu fördern, ist die Größe des PEG-Trägers größer als der ~5-nm-Grenzwert der glomerulären Nierenfiltrationsbarriere, so dass nur gespaltene Peptidsubstrate in den Urin ausgeschieden werden können, wobei die Größenfiltration durch die Nieren genutzt wird12. In diesem Protokoll wird der mehrstufige Arbeitsablauf für die Synthese und Anwendung von DNA-barcodierten aktivitätsbasierten Nanosensoren in einem präklinischen Mausmodell skizziert, wobei der Aufbau des CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Tests hervorgehoben wird, der von dieser Gruppe zur Klassifizierung des Krankheitsstatus in Mausmodellen mehrerer Krebsarten eingesetzt wurde13. Aufgrund des vielseitigen Designprinzips können alle drei Funktionskomponenten des Nanosensors – der Nanocarrier (PEG-Polymer), das stimuli-responsive Modul (Protease-aktiviertes Substrat) und der biofluidische Reporter (DNA-Barcode) – je nach anwendungsspezifischen Anforderungen präzise ausgetauscht werden, was eine Modularität durch maßgeschneiderte Ziel- und Freisetzungsspezifitäten ermöglicht.
Hier wird eine hochgradig anpassbare Plattform für die Multiplex-Krebserkennung mit einem tragbaren Urintest vorgestellt, der die krankheitsassoziierte proteolytische Aktivität mit einem minimalinvasiv injizierten Sensor bewertet. Bei Aktivierung durch Tumorproteasen wird die Peptidsubstratspaltung durch DNA-Barcode-Freisetzung in den Urin amplifiziert. Die synthetischen DNA-Reporter in einer Urinprobe können durch eine sekundäre CRISPR-Cas-vermittelte enzymatische Amplifikation mittels fluorometrischer Dete…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde teilweise durch einen Koch Institute Support Grant Nummer P30-CA14051 des National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), einen Core Center Grant P30-ES002109 des National Institute of Environmental Health Sciences, das Marble Center for Cancer Nanomedicine des Koch-Instituts, das Koch Institute Frontier Research Program über den Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund unterstützt. und der Virginia and D. K. Ludwig Fund for Cancer Research. A.E.V.H. wird durch ein NIH-finanziertes Predoctoral Training Fellowship (T32GM130546) unterstützt. S.N.B. ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. L.H. wird durch einen K99/R00 Pathway to Independence Award des National Cancer Institute und die Startfinanzierung der Boston University unterstützt.
10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |