3D-printbacteriën om beweeglijkheid en groei in complexe 3D-poreuze media te bestuderen

Het gebruik van een 3D-bioprinter met de granulaire hydrogelmatrix breidt de mogelijkheden van bioprinters uit om bacteriekolonies te printen in vormen die, wanneer ze in plaats daarvan op een plat substraat worden geprint, zouden inzakken vanwege de lage viscositeit van de bacteriële suspensie. De resolutie van de hier gepresenteerde aanpak hangt af van de extrusiesnelheid, de grootte van de naald, de snelheid van de printkop, de lucht in de naald en de viscositeit van de bacteriële suspensie. Vanwege het lage volume van de bacteriële suspensie kunnen er onbedoeld luchtbellen worden ingebracht tijdens het laden van de bacteriële suspensie in de spuit en naald. Dit kan ertoe leiden dat er een luchtbel wordt afgezet in de uiteindelijke geprinte structuur (Figuur 4). Een andere manier om luchtbellen in de afdruk te brengen, is als men de zuiger niet indrukt om een kleine druppel bacteriële suspensie aan de punt van de naald te vormen voordat u gaat afdrukken en er een luchtspleet bestaat aan de punt van de naald. Het niet indrukken van de zuiger van de spuit voor het printen kan er ook toe leiden dat verschillende volumes cellen in dezelfde batch worden geprint. Naarmate de tijd vordert, lost de luchtbel echter op in het omringende medium, zoals weergegeven in figuur 4. Voor het kalibreren van de extrusiestap is het gestorte volume afhankelijk van hoe de lineaire actuator van de printkop de zuiger van de spuit vertaalt, de binnendiameter van de spuit heeft een directe invloed op het volume. Verder zullen de reologische eigenschappen van bacteriële suspensie van invloed zijn op hoe gemakkelijk ze door de samentrekking van de naald scheren om soepel af te drukken. Deze kalibratieprocedure moet dus opnieuw worden uitgevoerd voor elke spuit/naald/bacteriële suspensie. In principe zou de kalibratie van de spuit kunnen worden geautomatiseerd. In de praktijk zou het echter een uitdaging zijn om een dergelijke code te schrijven die in grote lijnen van toepassing is op veel gebruiksscenario’s. Een gebruiker die bijvoorbeeld de extrusie van ongeveer 300 μl uit een spuit van 1 ml wil kalibreren, zou de spuit veel vaker opnieuw moeten laden dan een gebruiker die rond een doelvolume van 30 μl kalibreert. Aangezien de E-stap naar volumekalibratieconstante onbekend is wanneer het kalibratieproces begint, kan de gebruiker mogelijk niet precies voorspellen hoe vaak opnieuw laden daadwerkelijk nodig is. Om het kalibratieproces te automatiseren, zouden de exacte posities van elke voorgewogen buis van 1,5 ml moeten worden gespecificeerd. Om ervoor te zorgen dat alle bioinkt van de naald in de buis wordt afgezet voor een nauwkeurige kalibratie, moet nauwkeurig contact worden gemaakt tussen de naald en de bodem/wand van de buis. Zonder goed contact kunnen kleine druppeltjes nat blijven en aan de naald blijven zitten. Elke positievariatie tussen buizen kan dus in hoge mate bijdragen aan fouten in het kalibratieproces. Om deze redenen raden de auteurs aan dat elke gebruiker een kalibratieprogramma bouwt dat past bij zijn unieke behoeften. Een belangrijk kenmerk van de hier gepresenteerde aanpak is de mogelijkheid om bacteriën die zich rechtstreeks door hun omgeving verspreiden via beweeglijkheid en groei te visualiseren met behulp van beeldvorming. In een eerdere versie van het protocol voor beeldvorming werden platen met 6 putjes gevuld met 19 ml van een granulaire hydrogelmatrix. Maar zelfs met een succesvolle 3D-print van een horizontale lijn cellen die op een omgekeerde microscoop kan worden waargenomen, zou er ook een dichte kolonie groeien op het bovenoppervlak van het medium, waardoor visualisatie met helderveldmicroscopie wordt beperkt (Figuur 5). De kolonie op het bovenoppervlak was waarschijnlijk het gevolg van besmetting toen de naald van de spuit tijdens het printen in of verwijderd was van het medium. Om dit probleem te omzeilen, worden verticale lijnen van cellen afgedrukt in scintillatieflacons (Figuur 6A). De kromming van de cilindrische flacons veroorzaakte echter vervorming tijdens de beeldvorming. Dit leidde tot de keuze van platwandige cuvetten en weefselkweekkolven als monsterhouders voor het bedrukken, waardoor een onvervormde beeldvorming mogelijk is (figuur 6B-D). Een beperking van weefselkweekkolven is de kleine gekantelde hals die de geometrieën die kunnen worden afgedrukt beperkt. Alles bij elkaar maakt dit protocol het mogelijk om bacteriële motiliteit en groei in complexe poreuze omgevingen over lange tijdschalen te observeren. Enkele voorbeelden worden getoond in figuur 6B-G voor biofilmvormende V. cholerae met behulp van helderveldmicroscopie, evenals planktonische cellen van E. coli met behulp van laserscanning, fluorescentie, confocale microscopie, wat de veelzijdigheid van deze benadering aantoont. Een potentieel probleem van hydrogelmatrices is inderdaad hun mogelijke autofluorescentie wanneer ze worden afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie; de afbeeldingen in figuur 6F,G tonen echter aan dat een dergelijke autofluorescentie minimaal is in het hier gepresenteerde experimentele platform. Een andere beperking van dergelijke optische microscopiebenaderingen is hun ruimtelijke resolutie, die wordt ingesteld door de diffractielimiet op ~100 s nanometer; deze lengteschaal is echter veel kleiner dan de grootte van een individuele bacteriële cel, en daarom bieden optische technieken de mogelijkheid om bacteriële cellen af te beelden van de schaal van individuele cellen (Figuur 6G) tot de schaal van grotere, meercellige kolonies 30,31,32,33. Aanvullende voorbeelden worden hieronder beschreven. Zoals hierboven vermeld, kan de hier gepresenteerde aanpak worden gebruikt om bacteriekolonies in kleine (1 ml) en grote (20 ml) matrixvolumes in 3D-print en -beeld af te beelden. Daarom worden de verschillen in de resultaten verkregen met behulp van verschillende volumes hieronder beschreven, met behulp van 3D-geprinte kolonies van beweeglijke en niet-beweeglijke V. cholerae als representatieve voorbeelden. De ruimtelijke resolutie (breedte van de lijn) van de afdruk wordt bepaald door de binnendiameter van de nozzle. In de hieronder beschreven voorbeelden resulteert een naald met een binnendiameter van 0,6 mm in een initiële cilindrische kolonie van 0,6 mm. Eerder werk heeft aangetoond dat de printresolutie nog verder kan worden verlaagd door gebruik te maken van een getrokken glazen capillair met een binnendiameter van ~100-200 μm33. Voor de kleine volumes worden twee verschillende granulaire hydrogelmatrices gebruikt met twee verschillende poriegrootteverdelingen: één met een gemiddelde poriegrootte groter dan de gemiddelde diameter van een V. cholerae-cel, 0,2-0,4 μm36, en de andere met een gemiddelde poriegrootte kleiner dan deze diameter. De monsters gedurende twaalf dagen worden in beeld gebracht en gemeten door middel van beeldanalyse van de oppervlakte-uitbreiding van de kolonies in de loop van de tijd (Figuur 7 en Figuur 8). Voor niet-beweeglijke cellen, die zich alleen door cellulaire groei door hun omgeving kunnen verspreiden, was de snelheid van oppervlakte-expansie vergelijkbaar tussen de verschillende onderzochte matrices (Figuur 7), wat aangeeft dat verschillen in de poriegrootte van de matrix geen invloed hebben op cellulaire verspreiding door groei – zoals verwacht. Daarentegen, voor de beweeglijke cellen die zich door actieve beweeglijkheid door hun omgeving verspreiden, was de snelheid van oppervlakte-expansie van V. cholerae hoger voor de hydrogelmatrix met de grotere poriën – waarvoor opsluiting door de hydrogelkorrels de cellulaire beweeglijkheid minder belemmert. Deze verschillen in bacteriële verspreiding waren ook zichtbaar in de koloniemorfologieën (Figuur 8). De kolonie van V. cholerae in hydrogelmatrices met grotere poriën verspreidt zich door gladde, diffuse pluimen (figuur 8A), wat wijst op verspreiding door actieve beweeglijkheid, zoals eerder waargenomen32. In overeenstemming met deze interpretatie worden deze diffuse pluimen inderdaad niet waargenomen in het geval van niet-beweeglijke cellen (figuur 8C). Bovendien zijn de poriën voldoende groot zodat de cellen de kralen niet duwen als ze door de poriën zwemmen. Bovendien is de stroperige spanning die wordt uitgeoefend door zwemmen minder dan 1 Pa, wat onvoldoende is om de omringende hydrogelmatrix merkbaar te vervormen. Daarentegen verspreidt de kolonie in hydrogelmatrices met kleinere poriën zich alleen door ruwe, fractalachtige pluimen voor zowel beweeglijke als niet-beweeglijke cellen (Figuur 8B,D), wat de verspreiding uitsluitend weerspiegelt door cellulaire groei, terwijl de cellen groeien die tijdelijk vervormen en de omringende matrix opleveren. Aangezien de vloeispanning van de hydrogelmatrices veel kleiner is dan de turgordruk van de cellen, biedt de matrix in deze limiet van kleine poriegrootte slechts een zwakke weerstand tegen cellulaire groei en lijkt hij de 3D-geprinte structuur niet sterk te beïnvloeden, ook zoals geverifieerd in ons vorige werk37. Vergelijkbare resultaten worden waargenomen voor experimenten die worden uitgevoerd in monsters met een groot volume; Gezien de grotere overvloed aan voedingsstoffen in deze monsters, konden de experimenten de cellulaire groei over langere tijdschalen ondersteunen. Als voorbeeld worden resultaten getoond met behulp van de granulaire hydrogelmatrices waarbij de gemiddelde poriegrootte kleiner was dan de celgrootte – en dus was cellulaire spreiding voornamelijk te wijten aan groei. De monsters worden gedurende ~30 dagen afgebeeld in de granulaire hydrogelmatrices en gedurende de eerste 150 uur een vergelijkbare oppervlakte-expansie waargenomen voor zowel niet-beweeglijke als beweeglijke cellen; op nog langere tijdstippen wordt echter een sterke variabiliteit waargenomen tussen de monsters, waarbij sommige monsters een snellere verspreiding vertonen (figuur 9 en figuur 10). Interessant is dat bij het opnieuw bemonsteren van de hydrogelmatrix na het experiment – een voordeel van het grote volume van de hydrogelmatrix – een afname van de opbrengstspanning, opslagmoduli en verliesmoduli wordt gemeten (Figuur 11), wat aangeeft dat de matrices zachter werden. Deze verandering zou te wijten kunnen zijn aan het feit dat de V. cholerae een molecuul produceert dat de eigenschappen van de hydrogelmatrix verandert en de cellulaire verspreiding op lange tijden bevordert, wat interessant zal zijn om in toekomstig onderzoek te testen. Voorbeelden van de ruwe, fractal-achtige koloniemorfologieën die in deze experimenten resulteren, zijn weergegeven in figuur 10. Figuur 1: Afbeeldingen van de op maat gemaakte 3D-bioprinter. (A) Bioprinter met een aangepaste spuitpompextruderkop met een Luerlock-wegwerpspuit en naald. Bioprinter is ~46 cm breed. (B) Afbeelding van 3D-printen van cellen in kolven gevuld met vastgelopen hydrogelmatrix. De breedte van de afbeelding is 87 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2: Karakterisering van de reologische eigenschappen van de hydrogelmatrices in korrelvorm. (A) Schuifspanning als functie van de toegepaste afschuifsnelheid. (B) Opslag- en verliesmoduli, respectievelijk G’ en G”, als functie van de oscillatiefrequentie. De legenda geeft de hydrogelmassafractie aan die wordt gebruikt om elke hydrogelmatrix te bereiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Metingen van de poriegrootte van twee representatieve granulaire hydrogelmatrices. Door tracers te volgen, wordt de verdeling van karakteristieke porieafmetingen voor elke hydrogelmatrix bepaald. De gegevens worden weergegeven door 1-CDF, waarbij CDF de cumulatieve verdelingsfunctie is. De legenda geeft de hydrogelmassafractie aan die wordt gebruikt om elke matrix te bereiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Voorbeelden van belletjes die ontstaan tijdens het 3D-printen van bacteriën. (A) Schema van de beeldvormingsopstelling. (B) Snapshots van de groei van V. cholerae met een luchtbel aan de onderkant van de print (rode doos) in 1,2% hydrogelmatrix gezwollen in LB. Na 59 uur groeien bij 37 °C is de luchtbel volledig opgelost en zakt de kolonie terug door de elasticiteit van de hydrogelmatrix. Schaalbalk = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Afbeeldingen van de horizontale lijn van beweeglijke V. cholerae geprint in een plaat met zes putjes gevuld met 1,2% hydrogelmatrix gezwollen in LB en de biofilm die zich op het bovenoppervlak vormde na 48 uur incubatie bij 37 °C. (A) Schema van de beeldvormingsopstelling. (B) De biofilmvorming op het bovenoppervlak als gevolg van vervuiling tijdens 3D-printen vermindert de opaciteit en maakt geen duidelijke beeldvorming van de horizontale lijn mogelijk. Het bovenoppervlak vormt rimpels, vermoedelijk als gevolg van differentiële groei. Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6: Voorbeelden van verschillende monsterhouders die bij deze methode kunnen worden gebruikt. (A) V. cholerae na 470 uur afgedrukt in een glazen injectieflacon gevuld met 1,2% granulaire hydrogelmatrix. De kromming van de flacon maakt het moeilijk om de groei in beeld te brengen. Schaalbalken = 5 mm. (B) V. cholerae gedrukt in een micro-cuvet gevuld met 1,2% korrelige hydrogelmatrix. De platte zijkanten zorgen voor een duidelijke beeldvorming, maar de kleine volumes beperken de duur van experimenten voordat cellen geen groeisubstraten meer hebben. (C) Beeldvormingsopstelling met een zoomlens om V. cholerae in beeld te brengen, afgedrukt in een weefselkweekkolf gevuld met 1,2% korrelige hydrogelmatrix. Net als bij de micro-cuvettenkast zorgen de platte zijkanten voor een duidelijk beeld. De weefselkweekkolven kunnen worden gevuld met grotere volumes granulaire hydrogelmatrix, waardoor de experimentele tijdspanne wordt verlengd. (D) Beeld van de zoomlens van de V. cholerae , geprint in een 1,2% korrelige hydrogelmatrix na 100 uur incubatie bij 37 °C. Schaalbalk = 1 mm. (E) Beeldvormingsopstelling met een confocale microscoop om fluorescerende cellen in beeld te brengen. F) 3D-projectie van confocale microfoto’s van fluorescerende E. coli in de 1,2% granulaire hydrogelmatrix na 10 dagen incubatie bij 37 °C. Schaalbalk = 50 μm. (G) Confocale microfoto met eencellige resolutie van fluorescerende E. coli in de hydrogelmatrix. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Uitbreiding van het gebied als functie van de tijd van kolonies van V. cholerae afgedrukt in 1 ml granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrices. De gegevens op de plot zijn afkomstig uit de beeldanalyse van figuur 8. Er werd waargenomen dat beweeglijke cellen (gesloten rode cirkel en vierkant) zich sneller verspreiden dan de niet-beweeglijke cellen, wat een weerspiegeling is van verspreiding door zowel groei als beweeglijkheid. Bovendien verspreiden de beweeglijke cellen in de hydrogelmatrix met een grote poriegrootte (rode vierkanten) zich sneller dan de cellen in de hydrogelmatrix met poriën van 0,3 μm (rode cirkels). Niet-beweeglijke cellen vertonen geen verschil in oppervlakte-uitzettingssnelheid tussen de twee poriegroottes, omdat ze alleen maar groeien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Kolonies van V. cholerae geprint in 1 ml granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrices. (A) Snapshots van de groei en beweeglijkheid van beweeglijke V. cholerae in een 0,9% granulaire hydrogelmatrix waarbij de poriegrootte groter is dan de gemiddelde celdiameter. Pijlen geven een diffuse pluim aan die ontstaat als gevolg van cellen die door de hydrogelmatrix bewegen. (B) Snapshots van de groei en beweeglijkheid van beweeglijke V. cholerae in een 1,2% granulaire hydrogelmatrix waarbij de poriegrootte kleiner is dan de gemiddelde celdiameter. Pijlen geven een ruwe, fractalachtige pluim aan die zich vormt als gevolg van celgroei. (C) Momentopnamen van de tijdsevolutie van niet-beweeglijke V. cholerae in 0,9% granulaire hydrogelmatrix waarbij de poriegrootte groter is dan de gemiddelde celdiameter. In dit geval zijn diffuse pluimen die de beweeglijkheid weerspiegelen niet waarneembaar. (D) Snapshots van de groei van niet-beweeglijke V. cholerae in een 1,2% granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrix waarbij de poriegrootte kleiner is dan de gemiddelde celdiameter. In dit geval zijn ruwe, fractal-achtige pluimen die de groei weerspiegelen opnieuw waarneembaar. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Uitbreiding van het gebied als functie van de tijd van kolonies van V. cholerae geprint in 20 ml 1,2% granulaire hydrogel-ondersteuningsmatrices. Niet-beweeglijke (open cirkels) en beweeglijke cellen (gesloten cirkels) verspreiden zich gedurende de eerste 100 uur met vergelijkbare snelheden. Na 100 uur worden verschillen in de oppervlakte-expansiesnelheden waargenomen, mogelijk als gevolg van de evolutie van de variabiliteit op lange tijdstippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 10: Kolonies van V. cholerae geprint in 22 ml 1,2% korrelige hydrogelmatrices gekweekt bij 37 °C. (Boven) Snapshots van de groei van beweeglijke V. cholerae. (Onder) Snapshots van de groei van niet-beweeglijke V. cholerae. In beide gevallen zijn ruwe, fractal-achtige pluimen waarneembaar die de groei weerspiegelen. Schaalbalken = 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 11: Karakterisering van de reologische eigenschappen van de 1,2% granulaire hydrogelmatrix voor (0 uur) en na het experiment (397 uur). (A) Schuifspanning als functie van de toegepaste afschuifsnelheid. (B) Opslag- en verliesmoduli, respectievelijk G’ en G”, als functie van de toegepaste oscillatiefrequentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Gcode-opdrachten Taken M82 Absolute extrusiemodus M302 S0 Koude extrusie inschakelen M92 E14575 Stel de extrusiestappen per mm in G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 Stel de z-as en extrusiepositie in op nul, en de x-, y-positie op 35,71 mm en y 88 mm waar de printkop zich bevindt wanneer de g-code begint M221 S100 T0 stelt het debiet in op 100% M107 Zet de ventilator uit G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld G0 F200 Z60 Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min G0 F500 X65.81 Y81.0 Verplaats de naald naar de volgende monstercontiainer met een snelheid van 500 mm/min G0 F100 Z0 Laat de naald in de volgende monstercontiainer zakken naar dezelfde z-positie waar het printen begon met een snelheid van 100 mm/min G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld G0 F200 Z60 Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min G0 F500 X96.01 Y81.0 Verplaats de naald naar de volgende monstercontiainer met een snelheid van 500 mm/min G0 F100 Z0 Laat de naald in de monstercontiainer zakken in dezelfde z-positie waar het printen begon met een snelheid van 100 mm/min G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld G0 F200 Z60 Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min G0 F500 X126.21 Y81.0 Verplaats de naald naar de volgende monstercontiainer met een snelheid van 500 mm/min G0 F100 Z0 Laat de naald in de volgende monstercontiainer zakken naar dezelfde z-positie waar het printen begon met een snelheid van 100 mm/min G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 Extrudeer de 20 μL bioinkt in de matrix met een voedingssnelheid van 50 μL/min op de plaats waar de huidige positie is ingesteld G0 F200 Z80 Trek de naald uit de matrix en bemonster de contianer met een snelheid van 200 mm/min Tabel 1: G-code programmering voor het printen van verticale lijnen van de bacteriële suspensie. Aanvullend bestand 1: STL-vijl voor de onderste klem 1 ml wegwerp Luer lock-spuiten voor de spuitextruder. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 2: STL-vijl voor de bovenste klem voor 1 ml wegwerp Luer lock-spuiten voor de spuitextruder. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 3: STL-bestand voor de spuitadapter voor 1 ml Luer lock-wegwerpspuiten voor de spuitextruder. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 4: STL-vijl voor de cuvettenmonsterhouder. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend dossier 5: STL-vijl voor de monsterhouder van de weefselkolf. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 6: STL-bestand voor de 6-wells plaat en het 35 mm petrischaaldrukbed. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend bestand 7: Aangepast script voor het volgen van deeltjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.