Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells(인간 만능줄기세포와 장 신경계 계통의 분화)
Summary
인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 장 신경계(ENS) 계통을 추출하면 ENS 발병 및 질병을 연구하고 재생 의학에 사용할 수 있는 확장 가능한 세포 소스를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 뉴런을 유도하기 위한 자세한 in vitro 프로토콜이 제시됩니다.
Abstract
인간의 장 신경계(ENS)는 신경전달물질의 다양성이 현저한 신경교세포와 신경세포의 대규모 네트워크입니다. ENS는 장 운동성, 효소 분비, 영양소 흡수를 조절하고 면역 체계 및 장내 마이크로바이옴과 상호 작용합니다. 결과적으로, ENS의 발달 및 후천적 결함은 많은 인간 질병의 원인이 되며 파킨슨병의 증상에 기여할 수 있습니다. 동물 모델 시스템의 한계와 일차 조직에 대한 접근은 인간 ENS 연구에서 중요한 실험적 과제를 제기합니다. 여기에서는 정의된 배양 조건을 사용하여 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 ENS 계통을 효과적으로 체 외 에서 유도하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 당사의 프로토콜은 15일 이내에 hPSC를 장 신경능선 세포로 직접 분화하는 것으로 시작하여 30일 이내에 다양한 하위 유형의 기능성 장 신경 세포를 생성합니다. 이 플랫폼은 개발 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 애플리케이션을 위한 확장 가능한 리소스를 제공합니다.
Introduction
장 신경계(ENS)는 말초 신경계에서 가장 큰 구성 요소입니다. ENS는 위장관 내에 위치한 4억 개 이상의 뉴런을 포함하고 있으며 장의 거의 모든 기능을 제어합니다1. 장 신경병증의 ENS 발달 및 기능, 결함에 대한 분자적 이해를 위해서는 신뢰할 수 있고 확실한 장 신경 세포 공급원에 접근해야 합니다. 인간의 일차 조직에 대한 접근은 제한적이며, 동물 모델은 많은 장 신경병증에서 주요 질병 표현형을 요약하지 못합니다. 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 기술은 원하는 세포 유형, 특히 1차 공급원에서 분리하기 어려운 세포 유형을 무제한으로 제공하는 데 매우 유익한 것으로 입증되었습니다 2,3,4,5,6,7. 여기에서는 hPSC에서 ENS 배양을 얻기 위한 단계적이고 강력한 in vitro 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 이러한 확장 가능한 hPSC 유래 배양은 발달 연구, 질병 모델링 및 고처리량 약물 스크리닝을 위한 길을 열어주며 재생 의학을 위한 이식 가능한 세포를 제공할 수 있습니다.
장 뉴런 계통은 배아 발생 중 ENS 발달 경로를 따르는 신경 능선(NC) 세포에서 파생됩니다. 배아에서 NC 세포는 접히는 신경판의 가장자리를 따라 나타납니다. 그들은 증식, 이동 및 감각 뉴런, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 두개안면 골격 및 장 뉴런 및 아교 세포8,9,10을 포함한 다양한 세포 유형을 생성합니다. 세포의 운명 결정은 NC 세포가 나오는 전방-후방 축을 따라 뚜렷한 영역, 즉 두개골 NC, 미주 NC, 몸통 NC 및 천골 NC에 따라 달라집니다. ENS는 미주신경 및 천골 NC 세포에서 발생하며, 전자는 장의 길이를 따라 광범위하게 이동하고 장을 식민지화하기 때문에 장 뉴런의 집단을 지배합니다11.
PSC로부터 NC 세포를 유도하는 것은 일반적으로 이중 SMAD 억제와 WNT 경로 활성화의 조합을 포함한다12,13. 최근까지 모든 NC 유도 프로토콜에는 배양 조건에서 혈청 및 기타 동물성 제품 첨가제가 포함되었습니다. 화학적으로 정의되지 않은 매체는 NC 유도의 재현성을 낮출 뿐만 아니라 기계론적 발달 연구에 도전합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 Barber 등(14)은 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 NC 유도 프로토콜을 개발했으며, 따라서 혈청 치환 인자(예: KSR)에 의존하는 대체 방법보다 유리했습니다(예: KSR)13,14. 이는 기저 배지 치환과 Fattahi 등이 hPSC에서 장내 NC 세포를 유도하기 위해 처음 제시한 프로토콜을 최적화하여 얻은 것입니다. 이 개선된 시스템은 여기에 제시된 hPSC 차별화 프로토콜의 기초입니다. 레티노산(RA) 외에도 BMP, FGF, WNT 및 TGFβ 신호 전달을 정밀하게 조절하여 15일 동안 장 신경능선(ENC) 세포를 유도하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)로 세포를 처리하여 ENS 계통을 도출합니다. 모든 배지 조성은 화학적으로 정의되며 30-40일 이내에 강력한 장 신경 세포 배양을 생성합니다.
본 명세서에 기술된 단층 세포 배양 시스템 외에도, 자유-부유 배아체(15,16)를 사용하는 대안적인 NC 유도 접근법이 개발되었다. 이러한 배양에서 이동 세포는 미주 NC를 나타내는 부분 집합과 함께 NC 마커를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이러한 배양에서 장내 NC 전구체를 농축하기 위해 일차 장 조직과의 동반 배양이 사용되었습니다. 이 연구의 배지 구성에는 신경 성장 인자, NT3 및 뇌 유래 신경 영양 인자와 같은 다양한 요인의 조합이 포함되어 있습니다. 이 단계에서는 이러한 요인이 장 뉴런 전구체 헌신 정체성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 완전히 명확하지 않습니다. 단층과 배아체 기반 배양에서 장내 NC 유도를 효율적으로 비교하려면 더 많은 데이터가 필요합니다. 이러한 전략의 다양한 문화권 레이아웃을 감안할 때 각 방법의 사용을 고려하고 특정 응용 프로그램에 따라 최적화해야 합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 재현 가능하며 다른 hPSC(유도 및 배아) 라인 8,14,16을 사용하여 당사와 다른 사람들에 의해 성공적으로 테스트되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 분화 프로토콜은 30-40일 이내에 hPSC에서 장 뉴런을 얻고(그림 1E) 더 오래된 배양에서 신경교세포, GFAP 및 SOX10을 발현하는 장내 신경교세포를 얻기 위한 강력한 시험관 내 방법을 제공합니다(> 55일)13,14,19,22. 이러한 뉴런과 신경교세포는 hPSC를 미주신경 및 장…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research 및 Sandler Foundation의 보조금, March of Dimes 보조금 번호 1-FY18-394 및 1DP2NS116769-01, F.F.에 NIH Director’s New Innovator Award(DP2NS116769), F.F.에 대한 National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases(R01DK121169)의 보조금으로 지원되었으며, H.M.은 Larry L. Hillblom Foundation 박사후 연구원의 지원을 받습니다. NIH T32-DK007418 펠로우십 및 UCSF 획기적인 생물 의학 연구를 위한 프로그램, 독립적인 박사후 연구원.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Referenzen
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