Summary

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

Der Unterricht in den Biowissenschaften kann für die Studierenden durch Experimente anregender gestaltet werden. Dieses Manuskript stellt zwei verschiedene, aber sich ergänzende Protokolle vor, die im Unterricht verwendet werden können, um die Schüler zu ermutigen, Hypothesen in Bezug auf kalorienreiche Ernährung, Hunger und Altern zu formulieren und zu testen.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein transparenter, nicht-parasitärer Fadenwurm mit einer einfachen Biologie, was ihn durch die Färbung der Zellen oder ihres molekularen Inhalts zu einem großartigen Werkzeug für den Unterricht in den Biowissenschaften macht. Der Lugol-Farbstoff (Jod-Kaliumiodid-Lösung) wird in der Biochemie häufig zur Färbung von Glykogenspeichern verwendet. In diesem Zusammenhang ist es möglich, Unterschiede zwischen gefütterten und ausgehungerten Tieren zu beobachten, neben den Auswirkungen unterschiedlicher Bedingungen, wie z. B. unterschiedlicher Ernährung und Sauerstoffgehalt. Erioglaudin ist ein blauer Farbstoff, der auf den Verlust der Darmbarriere hinweist. Wenn die Darmbarriere intakt ist, färbt sich der blaue Farbstoff im Lumen ab; Wenn diese Integrität jedoch gestört ist, tritt der Farbstoff in die Körperhöhle ein. Mit einem Stereomikroskop oder einem Mikroskop können Lehrer physiologische und biochemische Veränderungen nachweisen oder sie können die Schüler dazu anregen, eine wissenschaftliche Frage zu stellen und ihre Hypothese mit diesen Assays zu stellen und zu testen. Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Färbetechniken bei C. elegans , die von den Studierenden leicht durchgeführt werden können.

Introduction

Der Unterricht in Biowissenschaften in der Oberstufe ist eine ständige Herausforderung. Insbesondere der Zugang und die Nutzung von Technologie haben wichtige Fortschritte im Lehr-Lern-Prozess gebracht, aber Tools wie Chatbots mit künstlicher Intelligenz erschweren die Rationalisierung und Suche nach Beweisen aufgrund einfacher (und manchmal falscher)Antworten 1. Aus diesem Grund ist die Verwendung einer wissenschaftlichen Methode mit praktischem Experimentieren in einem forschungsbasierten Ansatz im Unterricht eine wichtige Strategie, um kritisches Denken, Kreativität und technische Fähigkeiten bei den Schülern zu entwickeln oder zu stimulieren2.

In diesem Zusammenhang wurde der freilebende Fadenwurm Caenorhabditis elegans aufgrund seiner besonderen Vorteile erfolgreich in Versuchen zu Lehrzwecken3 eingesetzt: Er ist kein Parasit und die zur Fütterung verwendeten Escherichia coli entsprechen der Biosicherheitsstufe 1, wodurch die biologische Gefahr nahezu Null reduziert wird; Es hat eine elegante und quantifizierbare Fortbewegungsbewegung, die für die Schüler interessant zu beobachten ist; Und es ist transparent, was die Beobachtung von Organen, aber auch die Färbung mit Pigmenten ermöglicht, die auf das Vorhandensein von Biomolekülen oder das Auftreten physiologischer Veränderungen hinweisenkönnen 4. Daher ist es möglich, einfache Postulate in Bezug auf Biochemie und physiologische Veränderungen wie das Altern zu stellen und im Unterricht zu testen.

Glykogen ist ein Speicherkohlenhydrat, das aus einer langen und verzweigten Kette von Glukosemolekülen besteht, die aus Glucosylresten mit (1→4)-α glykosidischen linearen Bindungen und (1→6)-α glykosidischen Bindungen an Verzweigungspunkten gebildet werden und besonders wichtig für die Muskelkontraktion, die Zelldifferenzierung und die Aufrechterhaltung der Glykämiesind 5. Glykogen wird nach der Fütterung aufgrund der Insulinaktivierung des Enzyms Glykogensynthase synthetisiert. Während des Trainings oder des Fastens aktivieren Adrenalin bzw. Glucagon die Glykogenphosphorylase und bauen daher das Polysaccharid ab, um die Muskelzellen mit Glucose-6-phosphat zu versorgen oder freie Glukose freizusetzen, um Hypoglykämiezu umgehen 6,7. Veränderungen des Glykogenspiegels beeinflussen die Zelldifferenzierung, die Signalgebung, die Redoxregulation und die Stammzellen unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen, einschließlich Krebs8. Bei C. elegans kommt Glykogen hauptsächlich in der Speiseröhrenmuskulatur, der Unterhaut, im Darm, in den Neuronen und hauptsächlich in der Körperwandmuskulaturvor 9. Der Glykogengehalt kann mit der Lugolschen Jodlösung gemessen werden, da Jod in die spiralförmigen Spiralen bindet und einen Jod-Glykogen-Komplex bildet, der eine sichtbare scharfe blau-schwarze oder braun-schwarze Farbe ergibt, die erfolgreich zum Nachweis des Glykogengehalts in C. elegans10 verwendet wurde. Es wurde gezeigt, dass die Glykogenakkumulation, die durch eine hohe Glukosefütterung verursacht wird, die Lebensdauer des Wurms verkürzen und somit den Alterungsprozess beschleunigenkann 11,12. Darüber hinaus können Stoffwechselstörungen, andere Hormone und die Exposition gegenüber Xenobiotika den Glykogenstoffwechsel ebenfalls verändern13,14. Daher sind Experimente zum Glykogengehalt in C. elegans sehr interessant, da verschiedene Faktoren den Stoffwechsel stören können und eine Diskussion im Unterricht über grundlegende Biochemie im Zusammenhang mit Querschnittsthemen wie Bewegung, Ernährung, Krankheiten und Altern anregen können.

Altern ist ein zeitabhängiger Funktionsverlust, der durch zelluläre Schäden verursacht wird. Diese Schädigung kann mit oxidativem Stress, Telomerabrieb, Verlust der Proteostase, Entzündungen und sogar mit der Anhäufung unlöslicher Polyglucosankörper15 verbunden sein, um nur einige zu nennen. Eines der Kennzeichen des Alterns ist die Verringerung der Darmintegrität, die mit mehreren chronischen Erkrankungen verbunden ist, die während des Lebens eines Organismus auftreten16. Die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase hängt von der Integrität des Darmepithels ab, das durch Verbindungsproteine unterstützt wird, die eine physikalische Barriere bilden und benachbarte Epithelzellen verbinden. Bei einer Schädigung dieses Epithels kommt es zu einem Austritt des Luminalgehalts in das Interstitium17. Basierend auf diesem Mechanismus wurde der Schlumpf-Test verwendet, um die Darmintegrität in mehreren Tiermodellen zu überprüfen, da dieser blaue Farbstoff Erioglaucin-Dinatriumsalz die Darmmembran nicht durchdringt und im Lumenverbleibt 18. Wenn Würmer mit einem Krankheitserreger infiziert sind, mit einigen Giftstoffen kontaminiert sind oder altern, wodurch die interstitielle Integrität verändert wird, überwindet der Farbstoff die Barriere und breitet sich über den ganzen Wurm aus, der ganz blau wird. Dieser Assay ermöglicht es, die Physiologie des Alterns zu diskutieren und mit Faktoren zu experimentieren, die diesen Prozess beschleunigen oder verzögern können, indem sie Würmer verschiedenen Bedingungen aussetzen. Die Protokolle hier beschreiben im Detail diese beiden farbstoffbasierten Methoden, die leicht im Unterricht durchgeführt werden können, um die Schüler dazu anzuregen und zu stimulieren, Hypothesen in Bezug auf Biochemie und Physiologie zu formulieren und zu testen.

Der erste Teil des Protokolls zeigt seine Anwendbarkeit zur qualitativen und quantitativen Analyse des Glykogengehalts in C. elegans Modell10. Der zweite Teil des Protokolls dient der Beurteilung der Integrität des Darms von C. elegans . Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Alterung von C. elegans , indem die Integrität der Darmmembranen bewertet wird. Darüber hinaus ermöglicht es zu beurteilen, ob eine Substanz das Altern beschleunigt oder verzögert und ob Substanzen ein toxisches Potenzial für die Darmbarriere haben19.

Der für die vorliegende Studie verwendete C . elegans-Stamm war der Bristol N2-Wildtyp. Das Verfahren kann jedoch mit Stämmen repliziert werden, die vergleichbare Wachstumsraten aufweisen, oder die Methode muss je nach Bedarf an den Gerätewechsel angepasst werden, da sie die gleiche oder eine ähnliche Funktion haben, oder abhängig vom verwendeten Stamm, da bestimmte Stämme besondere Anforderungen an die Wartung und/oder Empfindlichkeit stellen; Diese Informationen können vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder der WormBase-Website bezogen werden. Diese Änderungen sollten die Reproduzierbarkeit der Methode nicht beeinträchtigen.

Protocol

HINWEIS: Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) Bakterien und Bristol N2 Wildtyp-Stämme können von der CGC, University of Minnesota, USA, oder durch Spende von einem C. elegans-Labor bezogen werden. Für die Sicherheit der Forscher ist es unerlässlich, persönliche Schutzausrüstung zu verwenden. Obwohl die Konzentrationen von Reagenzien wie Hypochlorit und Natriumhydroxid niedrig sind, ist es wichtig, die empfohlene PSA zu tragen, wie im Manuskript hervorgehoben, um mögliche Risiken im Zusammenhang mit diesen Chemikalien zu minimieren. 1. Glykogengehalt Vorbereitung von TestplattenBereiten Sie sechs 60 mm x 15 mm große NGM-Agarplatten20 (10 ml Nematoden-Wachstumsmedien-Agar, NGM, wie in der ergänzenden Tabelle 1 beschrieben) pro Wurmstamm vor und lassen Sie sie 1 Tag lang bei Raumtemperatur trocknen. Halten Sie die Platten geschlossen, um eine Kontamination zu vermeiden. Fügen Sie 200 μl E . coli OP50 Flüssigkultur (mit einer optischen Dichte = 0,600, ungefähr bei einer Wellenlänge von 600 nm) pro Platte hinzu, um insgesamt vier 60 mm x 15 mm große NGM-Platten pro Stamm in der Strömungshaube zu beimpfen. Lassen Sie die geschlossenen Platten 1 Tag lang bei 37 °C inkubieren, bevor Sie sie verwenden.HINWEIS: Bereiten Sie sechs Platten vor (Schritt 1.1), aber impfen Sie nur 4 mit E. coli OP50-Bakterien. Bewahren Sie die restlichen zwei Platten bei 4 °C für die spätere Verwendung auf, wenn Sie die Würmer unter Hungerbedingungen stellen. Diese Analyse kann doppelt durchgeführt werden. Am Testtag werden 200 μl 0,025 M D-Glucose auf zwei (6 mm x 15 mm) NGM-Agarplatten pro Stamm gegeben, die zuvor mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt wurden. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur in der Strömungshaube trocknen.HINWEIS: Die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelten NGM-Agarplatten können alternativ zur Verwendung einer Strömungshaube auch in der Nähe von Alkohollampen getrocknet werden. SynchronisationCa. 3 Tage vor der Synchronisation werden 3-4 Stücke (3 cm x 3 cm) von einem Erhaltungs-NGM-Agar mit C. elegans Bristol N2 (Wildtyp) in verschiedenen Stadien (ca. 500 Würmer pro Stück) auf eine neue Platte (150 mm x 90 mm) übertragen, die zuvor mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt wurde. Stellen Sie die neue Platte mit den Würmern in eine kontrollierte Umgebung bei 20 °C und halten Sie die Luftfeuchtigkeit 3 Tage lang >95 % (72 h lassen die meisten Würmer das trächtige Erwachsenenstadium erreichen).HINWEIS: Die Wachstumstemperatur muss je nach verwendetem/den verwendeten C. elegans-Stamm (en) möglicherweise angepasst werden. Sammeln Sie mit einer Pasteurpipette die Würmer aus der vorbereiteten Platte mit destilliertem H2O und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Warten Sie, bis die Würmer durch die Schwerkraft sedimentiert sind (ca. 15 Minuten) und entfernen Sie dann den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x, um die Bakterien zu eliminieren. Reduzieren Sie nach der letzten Wäsche das Volumen auf 5 ml. Fügen Sie 10 ml Bleichlösung hinzu (Ergänzende Tabelle 1) und schütteln Sie sie ca. 6 Minuten lang kräftig mit den Händen. Unmittelbar nach Beendigung des Schüttelns füllen Sie die Röhrchen mit M9-Puffer bis zu einem Fassungsvermögen von 50 ml. Zentrifugieren Sie 3 min lang bei 1400 x g , entfernen Sie den Überstand bis zu 5 mL und fügen Sie dann wieder 45 mL M9-Puffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x. Reduzieren Sie das Volumen nach dem letzten Waschen auf 15 ml und halten Sie es ca. 14 Stunden lang bei kontrollierter Temperatur (20 °C) und Luftfeuchtigkeit (>95 %).HINWEIS: Der Synchronisationsprozess kann durch die Gewinnung von Eiern durch Eiablage ersetzt werden: Übertragen Sie ca. 20 erwachsene trächtige Würmer auf eine NGM-Platte (6 mm x 15 mm), die zuvor mit 200 μl E. coli OP50 besät wurde. Lassen Sie die Würmer 1 Tag lang Eier legen. Entfernen Sie danach die trächtigen Würmer und warten Sie, bis die Eier geschlüpft sind. Vorbereitung von WürmernMit einer automatischen Pipette werden 10 μl der synchronisierten Würmer (Schritt 1.2.8) auf einen Objektträger gegeben und die Anzahl der Würmer gezählt. Berechnen Sie, wie viel Volumen pipettiert werden muss, um 500-1000 Würmer/μl zu erhalten. 500-1000 L1 synchronisierte Würmer (Schritt 1.2.8) werden auf NGM-Agarplatten (150 mm x 90 mm, Ergänzende Tabelle 1), die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind, als Nahrungsquelle übertragen, bis sie bei 20 °C das Larvenstadium 4 (L4) erreichen.HINWEIS: Würmer können mit einer automatischen Pipette übertragen werden. Wenn keine automatische Pipette verfügbar ist, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas, und das Volumen kann mit Mikroröhrchenetiketten oder Messpipetten aus Glas gesteuert werden. Nach 48 h Synchronisation20: Sammeln Sie die L4-Larven von den Platten mit M9-Puffer (Ergänzende Tabelle 1), mit Hilfe einer Plastik-Pasteurpipette in ein sauberes konisches Röhrchen 50 mL und waschen Sie sie 3x mit frischem M9-Puffer oder wiederholen Sie die Wäschen, bis alle verbleibenden E. coli OP50-Bakterien vollständig entfernt sind (bei Raumtemperatur).HINWEIS: Der Waschschritt ist wichtig, da einige Würmer während des Eingriffs verhungern. Ausführen des AssaysÜbertragen Sie 500-1000 L4-Würmer (Schritt 1.3.1) aus jeder der neuen NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm), die zuvor vorbereitet wurden (Schritte 1.1.2 und 1.1.3). Halten Sie sie bis zum Testtag 48 Stunden lang bei 20 °C. Dieser Zeitplan führt zu drei Versuchsgruppen wie folgt, in doppelter Ausführung (Abbildung 1):A- (Hunger): Würmer wachsen auf normalen NGM-Agarplatten ohne E. coli OP50-Bakterien;B- (regulär): Würmer wachsen auf normalen NGM-Agarplatten, die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind;C- (hoher Glukosespiegel): Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit E. coli OP50-Bakterien besiedelt sind und 0,025 M D-Glukose enthalten. Am Testtag (nach 48 h): Sammeln Sie die Würmer und waschen Sie sie dreimal kurz im M9-Puffer (Schritte 1.2.2 und 1.2.3)HINWEIS: Bereiten Sie hier NGM-Agarplatten unter Zugabe von D-Glukose vor (Schritt 1.3) und stellen Sie sie beiseite, bis es Zeit ist, die Würmer hinzuzufügen.Jodfärbung: Bereiten Sie eine 5%ige (v/v) Lugolsche Jodlösung (Jod/Kaliumiodid-Lösung) mit frischem M9-Puffer vor.HINWEIS: Lugols Jodlösung kann von lokalen Reagenzienlieferanten oder Apotheken bezogen werden, daher kann die Anfangskonzentration variieren. Falls erforderlich, berechnen Sie, um eine 5%ige (v/v) Lösung zu erhalten. Übertragen Sie ca. 100 μl gewaschene Würmer (Schritt 4.2) aus jeder Gruppe in das 1,5-ml-Mikroröhrchen mit verdünnter Lugol-Lösung (5 % v/v). Mit einer automatischen Pipette im Verhältnis 1:5 werden 100 μl Würmer auf 400 μl Lugol-Lösung übertragen, gefolgt von einem sanften Rühren in einem Mischer für 5 Minuten.HINWEIS: Wenn kein Mischer verfügbar ist, können die Mikroröhrchen vorsichtig mit den Händen geschüttelt werden. Gleich nach diesen 5 Minuten zentrifugieren Sie das 1,5 mL Mikroröhrchen (Würmer + Lugol-Lösung) bei 1400 x g für 3 min.HINWEIS: Wenn dieser Assay an Würmern aus dem L4-Stadium oder darüber hinaus durchgeführt wird, ist es möglich, eine Schwerkraftsedimentation anstelle einer Zentrifuge zu erreichen. Lassen Sie die Mikroröhrchen offen in Racks auf der Tischplatte für 10 Minuten, bis sich alle Würmer am Boden des Mikroröhrchens abgesetzt haben. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Würmer mit 1,0 ml frischem M9-Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche, bis das restliche Jod aus der Lösung entfernt ist (mindestens 3x). Nach dem letzten Waschschritt wird der Überstand bis auf einen Rückstand von ca. 100 μl entfernt. Verwenden Sie diesen, um die Würmer schonend zu resuspendieren und für mikroskopische Analysen. Übertragen Sie ca. 50 μl der resuspendierten Wurmlösung auf Mikroskopie-Objektträger und decken Sie diese mit Deckgläsern ab. Betrachten Sie die Hellfeldbilder mit einem Stereomikroskop (bei 1,5x).HINWEIS: Wenn kein Stereomikroskop verfügbar ist, kann ein normales Mikroskop verwendet werden, und Bilder können mit einer Handykamera (3,4x) unter Verwendung eines Adapters aufgenommen werden. Um Fehler durch Licht/Helligkeit/Belichtung zu vermeiden, ist es entscheidend, dass alle Einstellungen der Handykamera für alle Bilder gleich bleiben. Daten-InspektionQuantitative Daten: Berechnen Sie den Glykogengehalt anhand der Jodfärbung von Würmern.Speichern Sie Bilder aus dem Stereomikroskop, die mindestens 10 Würmer pro Gruppe enthalten, als .jpeg Datei zur weiteren Verarbeitung. Laden Sie dazu die kostenlose ImageJ-Software herunter. Einzelheiten finden Sie in der Ergänzungsdatei 1, der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Abbildung 2. Öffnen Sie das .jpeg Image mit der ImageJ-Software (die unter https://imagej.nih.gov/ij/download.html kostenlos heruntergeladen werden kann). Klicken Sie auf Segmentierte Linie und skizzieren Sie den Wurm (einen Wurm nach dem anderen). Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann Messen , um die Fleckenquantifizierung zu erhalten. Die Daten werden als Mittelwert in der Tabelle angezeigt. Der Mittelwert gibt die Daten an, die aus der Färbedichte pro Wurmfläche berechnet werden. Qualitative Daten: Erhalten Sie Bilder vom Stereomikroskop jeder Gruppe und vergleichen Sie visuell die Färbung der Würmer. Erstellen Sie bei Bedarf ein Bewertungssystem, um die Färbung zu analysieren: 0 farblos; 1 leicht gebeizt; 2 fleckig und 3 stark fleckig. Zählen Sie mit dem Stereomikroskop manuell ca. 10 Würmer pro Gruppe (Minimum) mit einem Handzähler. Abbildung 1: Schema des Assays für den Gesamtglykogengehalt in C. elegans. Ein Schema des hier durchgeführten Experiments zur Durchführung des Glykogengehalts-Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 2. Bewertung der Darmpermeabilität Vorbereitung von WürmernEtwa 14 h nach der Synchronisation (Schritt 1.2.8) werden 500-1000 Würmer (Schritt 1.3.1 und ANMERKUNG) im ersten Larvenstadium (L1) auf jede neue NGM-Agarplatte (60 mm x 15 mm) umgefüllt, die zuvor vorbereitet wurde, und bis zum Tag des Tests bei 20 °C aufbewahrt. Dieser Zeitplan führt zu zwei Versuchsgruppen wie folgt (Abbildung 2):A- (jung): Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit dem Bakterium E. coli OP50 besiedelt sind, bis zum Larvenstadium 4 (L4);B- (alt): Die Würmer wachsen auf NGM-Agarplatten, die mit dem Bakterium E. coli OP50 besiedelt sind, bis zum 7. Tag des Erwachsenenalters.HINWEIS: Die Würmer, die bis zum 7. Tag des Erwachsenenalters gehalten werden, müssen jeden Tag mit M9-Puffer gewaschen und auf neue NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm) mit 200 μl E. coli OP50-Bakterien übertragen werden, die zuvor als Nahrungsersatz und zur Entfernung der Nachkommen ausgesät wurden. Jüngere Würmer schwimmen während des Dekantierens und können durch Entfernen des Überstands abgetrennt werden. Der Anteil der Schlumpfwürmer nimmt mit zunehmendem Alter zu. Die Bewertung der Darmpermeabilität kann jedoch in jedem Stadium und Alter durchgeführt werden, abhängig vom Zweck der Studie. Ausführen des AssaysAm Testtag L4-Würmer (2 Tage nach Schritt 2.1.1) und adulte Würmer am 7. Tag (jetzt am 9. Tag) mit M9-Puffer sammeln (Ergänzende Tabelle 1) und in markierte 1,5-ml-Mikroröhrchen überführen. Bei 1400 x g für 3 min zentrifugieren, den Überstand entfernen, 1,0 mL M9 hinzufügen und vorsichtig mischen. Wiederhole diesen Vorgang 3x, um die Bakterien zu entfernen. Reduzieren Sie nach der letzten Wäsche das Volumen auf 500 μL. Geben Sie mit einer automatischen Pipette 10 μl des Wurmsediments auf einen Objektträger und zählen Sie die Anzahl der Würmer. Berechnen Sie das zu pipettierende Volumen, um 100 Würmer/μl zu erhalten. Schlumpffärbung: Bereiten Sie eine 25%ige Lösung aus Erioglaucin-Dinatriumsalz (Ergänzende Tabelle 1) mit destilliertem Wasser vor. Verwenden Sie ggf. den Wirbel für eine bessere Solubilisierung. In neue, zuvor identifizierte Mikroröhrchen wird mit einer automatischen Pipette das Volumen mit 100 Würmern, 100 μl 25%iger Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung, 200 μl E. coli OP50 und komplett mit M9-Puffer für ein Endvolumen von 500 μl hinzugefügt.HINWEIS: Die Volumina von Erioglaucin, Dinatrium, E. coli und die Anzahl der Würmer sind festgelegt. Das Volumen des M9-Puffers ist variabel und kann verwendet werden, um das endgültige Volumen auf 500 μL zu bringen. 3 h unter Rühren in einem Mischer, vor Licht geschützt, bei Raumtemperatur inkubieren.HINWEIS: Wenn kein Mixer verfügbar ist, schütteln Sie die Mikroröhrchen alle 15 Minuten vorsichtig mit den Händen. Nach 3 h zentrifugieren Sie das 1,5 mL Mikroröhrchen bei 1400 x g für 3 min. Entfernen Sie 1,0 mL Überstand und waschen Sie die Würmer mit 1,0 mL M9 Puffer. Wiederholen Sie die Wäschen, bis die restliche Erioglaucin-Dinatriumsalzlösung aus der Lösung entfernt wurde. Nach dem letzten Waschschritt wird der Überstand bis auf einen Rest von ca. 250 μl entfernt. Verwenden Sie diesen, um Würmer vorsichtig zu resuspendieren und für die mikroskopische Analyse zu verarbeiten. Übertragen Sie ca. 50 Würmer der resuspendierten Wurmlösung auf Objektträger und decken Sie diese mit Deckgläsern ab. Inkubieren Sie die Objektträger im Kühlschrank bei -20 °C für 10 min, um die Würmer zu lähmen.HINWEIS: Eine weitere Alternative, um die Würmer zu lähmen, besteht darin, 10 μl Levamisolhydrochloridlösung (10 mM ; Ergänzende Tabelle 1) und decken Sie sie mit Deckgläsern ab. Beobachten und zählen Sie die Gesamtzahl der Würmer und die vollständig gefärbten Würmer mit Hilfe des Hellfeldes in einem Stereomikroskop (bei 1,5x). Bilder können von einer Handykamera (mit 3,4x) in Verbindung mit einem Adapter aufgenommen werden. Um Fehler durch Licht/Helligkeit/Belichtung zu vermeiden, ist es entscheidend, dass alle Einstellungen der Handykamera für alle Bilder gleich bleiben. Daten-InspektionQualitative Daten: Erhalten Sie Stereomikroskopische Bilder von jeder Gruppe (L4 und 7. Tag des Erwachsenenalters) und vergleichen Sie visuell die Färbung der Würmer. Zählen Sie die Gesamtzahl der Würmer und die Anzahl der Schlumpfwürmer (Blauwürmer) mit einem Stereomikroskop. Geben Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der Schlumpfwürmer aus, indem Sie die jungen Würmer (L4, als Kontrollgruppe) und die alten Würmer (7. Tag des Erwachsenenalters) vergleichen:A x X = 100 (%) x BX = 100 x B / ADabei ist A = Gesamtzahl der WürmerB= Anzahl der Schlumpfwürmer Abbildung 2: Schema des Gesamtpermeabilitätstests für den Darm bei C. elegans. (A) Zubereitung von C. elegans . (B) Färbung mit Erioglaucin-Dinatriumsalz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Representative Results

Der Glykogengehalt-Assay bietet eine robuste und schnelle Methode für das Screening verschiedener Testbedingungen, wie z. B. vergleichende Studien verschiedener Stämme, die die Glykogensynthese oder den Glykogenabbau beeinflussen können. In dieser Studie wurden L4-Würmer drei verschiedenen Testbedingungen unterzogen: Nüchtern-, Fütterungs- und Glukose-angereicherte Gruppen. Der Assay wurde dreimal durchgeführt, wobei jeder Zustand in jedem Assay zweimal repliziert wurde; In <stron…

Discussion

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine qualitative Bewertung des Glykogengehalts in einzelnen C. elegans-Würmern mittels Lugol-Färbung ermöglicht: ein unkomplizierter, robuster und schneller Assay. Die Lugol-Färbung ist ein markierungsfreier und nicht-invasiver Ansatz, der die Erfassung molekularer Daten mit subzellulärer Auflösung erleichtert und die Überwachung von Schwankungen des Glykogengehalts innerhalb einzelner Würmer ermöglicht<sup class=…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.S.A. bedankt sich für die Finanzierung durch den Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brasilien), Fördernummer #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brasilien), Fördernummer 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finanzcode 001 für N.S.J und A.C.S)

Materials

1.5 mL microtubes  Local suppliers
37-degree incubator KS 4000i  97014-816
50 mL conical tube Local suppliers
6 cm Petri plates  Local suppliers
Agar bacteriological Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (wild type) Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)
CaCL2 Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 10035-04-8
Cholesterol Sigma-Aldrich Brasil Ltda 57-88-5
D-(+)-Glucose anhydrous  Neon 50-99-7
Distilled H2O Local suppliers
Erioglaucine disodium salt Sigma-Aldrich Brasil Ltda 3844-45-9
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)
Flow hood Mylabor
Incubator Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA.
KH2PO4 Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 7778-77-0
Levamisole hydrochloride RIPERCOL L 150F
Lugol solution Sigma-Aldrich Brasil Ltda L6146
MgSO4 Synth S1063-01-AH
Microcentrifuge Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany
Na2HPO4 Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 7558-79-4
NaCl Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 7647-14-5
Nystatin Sigma-Aldrich Brasil Ltda N6261
Peptone bacteriological êxodo científica 91079-38-8
Stereomicroscope Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil)
Streptomycin Sulfate Estreptomax

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Jardim, N. S., Silva, A. C., Avila, D. S. Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (204), e66084, doi:10.3791/66084 (2024).

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