Der Unterricht in den Biowissenschaften kann für die Studierenden durch Experimente anregender gestaltet werden. Dieses Manuskript stellt zwei verschiedene, aber sich ergänzende Protokolle vor, die im Unterricht verwendet werden können, um die Schüler zu ermutigen, Hypothesen in Bezug auf kalorienreiche Ernährung, Hunger und Altern zu formulieren und zu testen.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein transparenter, nicht-parasitärer Fadenwurm mit einer einfachen Biologie, was ihn durch die Färbung der Zellen oder ihres molekularen Inhalts zu einem großartigen Werkzeug für den Unterricht in den Biowissenschaften macht. Der Lugol-Farbstoff (Jod-Kaliumiodid-Lösung) wird in der Biochemie häufig zur Färbung von Glykogenspeichern verwendet. In diesem Zusammenhang ist es möglich, Unterschiede zwischen gefütterten und ausgehungerten Tieren zu beobachten, neben den Auswirkungen unterschiedlicher Bedingungen, wie z. B. unterschiedlicher Ernährung und Sauerstoffgehalt. Erioglaudin ist ein blauer Farbstoff, der auf den Verlust der Darmbarriere hinweist. Wenn die Darmbarriere intakt ist, färbt sich der blaue Farbstoff im Lumen ab; Wenn diese Integrität jedoch gestört ist, tritt der Farbstoff in die Körperhöhle ein. Mit einem Stereomikroskop oder einem Mikroskop können Lehrer physiologische und biochemische Veränderungen nachweisen oder sie können die Schüler dazu anregen, eine wissenschaftliche Frage zu stellen und ihre Hypothese mit diesen Assays zu stellen und zu testen. Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Färbetechniken bei C. elegans , die von den Studierenden leicht durchgeführt werden können.
Der Unterricht in Biowissenschaften in der Oberstufe ist eine ständige Herausforderung. Insbesondere der Zugang und die Nutzung von Technologie haben wichtige Fortschritte im Lehr-Lern-Prozess gebracht, aber Tools wie Chatbots mit künstlicher Intelligenz erschweren die Rationalisierung und Suche nach Beweisen aufgrund einfacher (und manchmal falscher)Antworten 1. Aus diesem Grund ist die Verwendung einer wissenschaftlichen Methode mit praktischem Experimentieren in einem forschungsbasierten Ansatz im Unterricht eine wichtige Strategie, um kritisches Denken, Kreativität und technische Fähigkeiten bei den Schülern zu entwickeln oder zu stimulieren2.
In diesem Zusammenhang wurde der freilebende Fadenwurm Caenorhabditis elegans aufgrund seiner besonderen Vorteile erfolgreich in Versuchen zu Lehrzwecken3 eingesetzt: Er ist kein Parasit und die zur Fütterung verwendeten Escherichia coli entsprechen der Biosicherheitsstufe 1, wodurch die biologische Gefahr nahezu Null reduziert wird; Es hat eine elegante und quantifizierbare Fortbewegungsbewegung, die für die Schüler interessant zu beobachten ist; Und es ist transparent, was die Beobachtung von Organen, aber auch die Färbung mit Pigmenten ermöglicht, die auf das Vorhandensein von Biomolekülen oder das Auftreten physiologischer Veränderungen hinweisenkönnen 4. Daher ist es möglich, einfache Postulate in Bezug auf Biochemie und physiologische Veränderungen wie das Altern zu stellen und im Unterricht zu testen.
Glykogen ist ein Speicherkohlenhydrat, das aus einer langen und verzweigten Kette von Glukosemolekülen besteht, die aus Glucosylresten mit (1→4)-α glykosidischen linearen Bindungen und (1→6)-α glykosidischen Bindungen an Verzweigungspunkten gebildet werden und besonders wichtig für die Muskelkontraktion, die Zelldifferenzierung und die Aufrechterhaltung der Glykämiesind 5. Glykogen wird nach der Fütterung aufgrund der Insulinaktivierung des Enzyms Glykogensynthase synthetisiert. Während des Trainings oder des Fastens aktivieren Adrenalin bzw. Glucagon die Glykogenphosphorylase und bauen daher das Polysaccharid ab, um die Muskelzellen mit Glucose-6-phosphat zu versorgen oder freie Glukose freizusetzen, um Hypoglykämiezu umgehen 6,7. Veränderungen des Glykogenspiegels beeinflussen die Zelldifferenzierung, die Signalgebung, die Redoxregulation und die Stammzellen unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen, einschließlich Krebs8. Bei C. elegans kommt Glykogen hauptsächlich in der Speiseröhrenmuskulatur, der Unterhaut, im Darm, in den Neuronen und hauptsächlich in der Körperwandmuskulaturvor 9. Der Glykogengehalt kann mit der Lugolschen Jodlösung gemessen werden, da Jod in die spiralförmigen Spiralen bindet und einen Jod-Glykogen-Komplex bildet, der eine sichtbare scharfe blau-schwarze oder braun-schwarze Farbe ergibt, die erfolgreich zum Nachweis des Glykogengehalts in C. elegans10 verwendet wurde. Es wurde gezeigt, dass die Glykogenakkumulation, die durch eine hohe Glukosefütterung verursacht wird, die Lebensdauer des Wurms verkürzen und somit den Alterungsprozess beschleunigenkann 11,12. Darüber hinaus können Stoffwechselstörungen, andere Hormone und die Exposition gegenüber Xenobiotika den Glykogenstoffwechsel ebenfalls verändern13,14. Daher sind Experimente zum Glykogengehalt in C. elegans sehr interessant, da verschiedene Faktoren den Stoffwechsel stören können und eine Diskussion im Unterricht über grundlegende Biochemie im Zusammenhang mit Querschnittsthemen wie Bewegung, Ernährung, Krankheiten und Altern anregen können.
Altern ist ein zeitabhängiger Funktionsverlust, der durch zelluläre Schäden verursacht wird. Diese Schädigung kann mit oxidativem Stress, Telomerabrieb, Verlust der Proteostase, Entzündungen und sogar mit der Anhäufung unlöslicher Polyglucosankörper15 verbunden sein, um nur einige zu nennen. Eines der Kennzeichen des Alterns ist die Verringerung der Darmintegrität, die mit mehreren chronischen Erkrankungen verbunden ist, die während des Lebens eines Organismus auftreten16. Die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase hängt von der Integrität des Darmepithels ab, das durch Verbindungsproteine unterstützt wird, die eine physikalische Barriere bilden und benachbarte Epithelzellen verbinden. Bei einer Schädigung dieses Epithels kommt es zu einem Austritt des Luminalgehalts in das Interstitium17. Basierend auf diesem Mechanismus wurde der Schlumpf-Test verwendet, um die Darmintegrität in mehreren Tiermodellen zu überprüfen, da dieser blaue Farbstoff Erioglaucin-Dinatriumsalz die Darmmembran nicht durchdringt und im Lumenverbleibt 18. Wenn Würmer mit einem Krankheitserreger infiziert sind, mit einigen Giftstoffen kontaminiert sind oder altern, wodurch die interstitielle Integrität verändert wird, überwindet der Farbstoff die Barriere und breitet sich über den ganzen Wurm aus, der ganz blau wird. Dieser Assay ermöglicht es, die Physiologie des Alterns zu diskutieren und mit Faktoren zu experimentieren, die diesen Prozess beschleunigen oder verzögern können, indem sie Würmer verschiedenen Bedingungen aussetzen. Die Protokolle hier beschreiben im Detail diese beiden farbstoffbasierten Methoden, die leicht im Unterricht durchgeführt werden können, um die Schüler dazu anzuregen und zu stimulieren, Hypothesen in Bezug auf Biochemie und Physiologie zu formulieren und zu testen.
Der erste Teil des Protokolls zeigt seine Anwendbarkeit zur qualitativen und quantitativen Analyse des Glykogengehalts in C. elegans Modell10. Der zweite Teil des Protokolls dient der Beurteilung der Integrität des Darms von C. elegans . Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Alterung von C. elegans , indem die Integrität der Darmmembranen bewertet wird. Darüber hinaus ermöglicht es zu beurteilen, ob eine Substanz das Altern beschleunigt oder verzögert und ob Substanzen ein toxisches Potenzial für die Darmbarriere haben19.
Der für die vorliegende Studie verwendete C . elegans-Stamm war der Bristol N2-Wildtyp. Das Verfahren kann jedoch mit Stämmen repliziert werden, die vergleichbare Wachstumsraten aufweisen, oder die Methode muss je nach Bedarf an den Gerätewechsel angepasst werden, da sie die gleiche oder eine ähnliche Funktion haben, oder abhängig vom verwendeten Stamm, da bestimmte Stämme besondere Anforderungen an die Wartung und/oder Empfindlichkeit stellen; Diese Informationen können vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder der WormBase-Website bezogen werden. Diese Änderungen sollten die Reproduzierbarkeit der Methode nicht beeinträchtigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll eine qualitative Bewertung des Glykogengehalts in einzelnen C. elegans-Würmern mittels Lugol-Färbung ermöglicht: ein unkomplizierter, robuster und schneller Assay. Die Lugol-Färbung ist ein markierungsfreier und nicht-invasiver Ansatz, der die Erfassung molekularer Daten mit subzellulärer Auflösung erleichtert und die Überwachung von Schwankungen des Glykogengehalts innerhalb einzelner Würmer ermöglicht<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
D.S.A. bedankt sich für die Finanzierung durch den Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brasilien), Fördernummer #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brasilien), Fördernummer 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Finanzcode 001 für N.S.J und A.C.S)
1.5 mL microtubes | Local suppliers | – | |
37-degree incubator | KS 4000i | 97014-816 | |
50 mL conical tube | Local suppliers | – | |
6 cm Petri plates | Local suppliers | – | |
Agar bacteriological | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 9002-18-0 | |
C. elegans Bristol N2 (wild type) | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | – | |
CaCL2 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 10035-04-8 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 57-88-5 | |
D-(+)-Glucose anhydrous | Neon | 50-99-7 | |
Distilled H2O | Local suppliers | – | |
Erioglaucine disodium salt | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 3844-45-9 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | – | |
Flow hood | Mylabor | ||
Incubator | Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA. | – | |
KH2PO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7778-77-0 | |
Levamisole hydrochloride | RIPERCOL L 150F | – | |
Lugol solution | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | L6146 | |
MgSO4 | Synth | S1063-01-AH | |
Microcentrifuge | Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany | ||
Na2HPO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7558-79-4 | |
NaCl | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7647-14-5 | |
Nystatin | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | N6261 | |
Peptone bacteriological | êxodo científica | 91079-38-8 | |
Stereomicroscope | Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil) | ||
Streptomycin Sulfate | Estreptomax | – |