Patient-Derived Tumor Organoids sind ein ausgeklügeltes Modellsystem für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Methodenartikel beschreibt die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zur gleichzeitigen kinetischen Beurteilung verschiedener Organoid-Phänotypen.
Patient-Derived Organoid (PDO) Modelle von Krebs sind ein multifunktionales Forschungssystem, das menschliche Krankheiten im Vergleich zu Krebszelllinien besser rekapituliert. PDO-Modelle können erzeugt werden, indem Tumorzellen von Patienten in extrazellulären Basalmembranextrakten (BME) kultiviert und als dreidimensionale Kuppeln plattiert werden. Kommerziell erhältliche Reagenzien, die für phänotypische Assays in Monolayer-Kulturen optimiert wurden, sind jedoch oft nicht mit BME kompatibel. Hier beschreiben wir eine Methode zur Platte von PDO-Modellen und zur Bewertung von Arzneimittelwirkungen mit einem automatisierten Lebendzell-Bildgebungssystem. Darüber hinaus verwenden wir Fluoreszenzfarbstoffe, die mit kinetischen Messungen kompatibel sind, um die Zellgesundheit und Apoptose gleichzeitig zu quantifizieren. Die Bilderfassung kann so angepasst werden, dass sie in regelmäßigen Zeitabständen über mehrere Tage erfolgt. Benutzer können Arzneimittelwirkungen in einzelnen Z-Ebenenbildern oder einer Z-Projektion von Serienbildern aus mehreren Brennebenen analysieren. Mit Hilfe der Maskierung werden bestimmte Parameter von Interesse berechnet, wie z. B. PDO-Zahl, Fläche und Fluoreszenzintensität. Wir liefern Proof-of-Concept-Daten, die die Wirkung von Zytostatika auf die Zellgesundheit, Apoptose und Lebensfähigkeit demonstrieren. Diese automatisierte kinetische Bildgebungsplattform kann auf andere phänotypische Messwerte erweitert werden, um verschiedene therapeutische Effekte in PDO-Modellen von Krebs zu verstehen.
Von Patienten stammende Tumororganoide (PDOs) entwickeln sich schnell zu einem robusten Modellsystem zur Untersuchung der Krebsentwicklung und des therapeutischen Ansprechens. PDOs sind dreidimensionale (3D) Zellkultursysteme, die das komplexe genomische Profil und die Architektur des Primärtumors rekapitulieren 1,2. Im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Kulturen immortalisierter Krebszelllinien erfassen und erhalten PDOs die intratumorale Heterogenität 3,4, was sie zu einem wertvollen Werkzeug sowohl für die mechanistische als auch für die translationale Forschung macht. Obwohl PDOs ein immer beliebteres Modellsystem werden, sind kommerziell erhältliche Reagenzien und Analysemethoden für zelluläre Effekte, die mit PDO-Kulturen kompatibel sind, begrenzt.
Der Mangel an robusten Methoden zur Analyse subtiler Veränderungen des Behandlungsansprechens behindert die klinische Umsetzung. Das Goldstandard-Reagenz für die Zellgesundheit in 3D-Kulturen, CellTiter-Glo 3D, verwendet den ATP-Spiegel als Determinante für die Zellviabilität 5,6. Obwohl dieses Reagenz für Endpunkt-Assays nützlich ist, gibt es mehrere Vorbehalte, vor allem die Unfähigkeit, Proben nach Abschluss des Assays für andere Zwecke zu verwenden.
Die Lebendzellbildgebung ist eine ausgeklügelte Form der kinetischen Mikroskopie, die in Kombination mit fluoreszierenden Reagenzien in der Lage ist, eine Vielzahl von Messwerten für die Zellgesundheit innerhalb von PDO-Modellen zu quantifizieren, einschließlich Apoptose 7,8,9 und Zytotoxizität10. In der Tat war die Bildgebung lebender Zellen ein wesentlicher Bestandteil des Hochdurchsatz-Screenings von Verbindungen in 2D-Plattformen11,12. Systeme wie der Incucyte haben die Technologie erschwinglich und damit für Forschungsgruppen in einer Vielzahl von Umgebungen zugänglich gemacht. Die Anwendung dieser Systeme zur Analyse von 3D-Kulturen steckt jedoch noch in den Kinderschuhen.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Bewertung des Ansprechens auf Medikamente in PDO-Modellen von Krebs unter Verwendung von Multiplex-Lebendzell-Bildgebung (Abbildung 1). Durch die Analyse von Hellfeldbildern können Veränderungen der PDO-Größe und -Morphologie kinetisch überwacht werden. Darüber hinaus können zelluläre Prozesse gleichzeitig im Zeitverlauf mit fluoreszierenden Reagenzien wie Annexin V Red Dye für Apoptose und Cytotox Green Dye für Zytotoxizität quantifiziert werden. Die vorgestellten Methoden sind für das Lebendzell-Bildgebungssystem Cytation 5 optimiert, aber dieses Protokoll kann an verschiedene Lebendzell-Bildgebungsplattformen angepasst werden.
PDO-Kulturen werden aufgrund ihrer Fähigkeit, zelluläre Reaktionen und Verhaltensweisen widerzuspiegeln, zu einem immer beliebteren In-vitro-Modellsystem2. Bedeutende Fortschritte wurden bei der Erzeugung, Kultur und Expansion von PDO-Techniken erzielt, aber Methoden zur Analyse therapeutischer Reaktionen hinken hinterher. Kommerziell erhältliche 3D-Viabilitätskits sind lytische Endpunkt-Assays, bei denen potenziell wertvolle Daten zur kinetischen Reaktion fehlen und nachfolgende Analysen durc…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Tissue Procurement Core und Dr. Kristen Coleman von der University of Iowa für die Bereitstellung von Tumorproben und Dr. Sofia Gabrilovich in der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie für die Unterstützung bei der PDO-Modellgenerierung. Wir danken auch Dr. Valerie Salvatico (Agilent, USA) für die kritische Analyse des Manuskripts. Wir erkennen die folgenden Finanzierungsquellen an: NIH/NCI CA263783 und DOD CDMRP CA220729P1 an KWT; Cancer Research UK, Prostate Cancer UK, Prostate Cancer Foundation und Medical Research Council an JSdB. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Planung oder Analyse von Experimenten oder der Entscheidung zur Veröffentlichung.
1.5 mL microcentrfuge tube | Dot Scientific Inc | 1008113 | |
15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.100 | |
554 NM LED Cube | Agilent | 1225012 | |
96-well plate | Corning Costar | 3596 | Prewarmed to 37 °C |
96-well plate | Agilent | 204626-100 | Prewarmed to 37 °C |
A83-01 | Tocris | 2939 | Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media) |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634-010 | component of organoid culture media |
B27 Supplement | Gibco | 17504044 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator | Agilent | BIOSPAG-SN | Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10) |
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader | Agilent | CYT5PW-SN | Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08) |
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Systems | BME001-10 | |
Daunorubicin HCl | Sigma-Aldrich | S3035 | Reconstituted in DMSO |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
EDTA (0.5 M) | Thermo Fisher | AM9260G | |
Forskolin | Tocris | 1099 | Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media) |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Final concentration is 1x (component of organoid culture media) |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein | Gibco | AF-100-15-1MG | Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
Human FGF-10 Recombinant Protein | Gibco | 100-26-1MG | Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media) |
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein | Gibco | 120-38-5UG | Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media) |
Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technologies | 7926 | Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media) |
Imaging Filter Cube- GFP | Agilent | 1225101 | |
Imaging Filter Cube- TRITC | Agilent | 1225125 | |
Imaging LED GFP/CFP | Agilent | 1225001 | |
Incucyte Annexin V Red Dye | Sartorius | 4641 | Reconstituted in organoid culture media |
Incucyte Cytotox Green Dye | Sartorius | 4633 | DMSO solution |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media) |
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution | Fisher-Scientific | 13366169 | Add 1:50 volume |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media) |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media) |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media) |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-144 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media) |
Recombinant Human Heregulinβ-1 | Pepro Tech | 100-03 | Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media) |
Staurosporine solution from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | S6942 | |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
Y-27632, CAS 331752-47-7 | Sigma-Aldrich | 688000 | Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media) |
β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media) |