Dieses Protokoll zielt darauf ab, biofunktionelle selbstorganisierende Peptide auf Zelladhäsion, Organoidmorphologie und Genexpression durch Immunfärbung zu bewerten. Wir werden eine Darmkrebszelllinie verwenden, um eine kostengünstige Möglichkeit zu bieten, Organoide für intensive Tests zu gewinnen.
Ultrakurze selbstorganisierende Peptide (SAPs) können spontan Nanofasern bilden, die der extrazellulären Matrix ähneln. Diese Fasern ermöglichen die Bildung von Hydrogelen, die biokompatibel, biologisch abbaubar und nicht immunogen sind. Wir haben bereits bewiesen, dass SAPs, wenn sie mit proteinabgeleiteten Motiven biofunktionalisiert werden, die extrazellulären Matrixeigenschaften nachahmen können, die die Bildung kolorektaler Organoide unterstützen. Diese biofunktionellen Peptid-Hydrogele behalten die mechanischen Eigenschaften, die Abstimmbarkeit und die Druckbarkeit des ursprünglichen Ausgangspeptids bei und enthalten gleichzeitig Hinweise, die Zell-Matrix-Wechselwirkungen ermöglichen, um die Zelladhäsion zu erhöhen. In diesem Artikel werden die Protokolle vorgestellt, die erforderlich sind, um die Auswirkungen verschiedener biofunktioneller Peptidhydrogele auf die Zelladhäsion und Lumenbildung unter Verwendung einer Adenokarzinom-Krebszelllinie zu bewerten und zu charakterisieren, die in der Lage ist, kolorektale Krebsorganoide kostengünstig zu bilden. Diese Protokolle werden dazu beitragen, die Auswirkungen von biofunktionellen Peptid-Hydrogelen auf die Zelladhäsion und die Luminalbildung mithilfe von Immunfärbung und Fluoreszenzbildanalyse zu bewerten. Die in dieser Studie verwendete Zelllinie wurde zuvor zur Erzeugung von Organoiden in tierischen Matrizen verwendet.
In den letzten Jahren haben sich selbstorganisierende Peptide (SAPs) als vielversprechende Biomaterialien für Tissue-Engineering-Anwendungen herauskristallisiert. SAPs besitzen einzigartige Eigenschaften, darunter die spontane Bildung von Nanofasern, Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit und Nicht-Immunogenität, was sie zu attraktiven Kandidaten für die Gerüstentwicklungmacht 1. SAPs wurden zuvor zusammen mit verschiedenen Zelltypen verwendet, und insbesondere berichtete ultrakurze SAPs haben die Verkapselung von Stammzellen erleichtert und gleichzeitig ihre Pluripotenz über längere Zeiträume von mehr als 30 Passagen und mit minimaler Inzidenz von Chromosomenaberrationen aufrechterhalten 2,3,4. Daher war die Adaption von SAPs für ihren Einsatz in der Organoidkultur ein rationaler Folgeschritt.
Organoide sind komplexe dreidimensionale Strukturen, die aus einzelnen pluripotenten Zellen entstehen. Aus diesen Strukturen entstehen verschiedene Zelltypen, die sich dann selbst organisieren, um die Entwicklungsprozesse des Embryonal- und Gewebewachstums in vitro zu replizieren 5. Dieses innovative Framework hat sich zu einem beeindruckenden Werkzeug für In-vitro-Untersuchungen entwickelt, das die genetischen, phänotypischen und verhaltensbezogenen Merkmale, die für In-vivo-Organe charakteristisch sind, effizient konserviert6. Nichtsdestotrotz ist ein Haupthindernis für den Übergang von Organoid-basierten Befunden vom Labor zum Krankenbett die Notwendigkeit der Reproduzierbarkeit7. Diese Variation der Ergebnisse wird in erster Linie auf die Schwierigkeit zurückgeführt, humane pluripotente Stammzellen vollständig in spezialisierte Zelllinien zu differenzieren, die durch das Fehlen einer authentischen Gewebearchitektur und die inhärente Komplexität, die in Organoidmodellen angetroffen wird, noch verstärkt wird. Angesichts der zunehmenden Popularität von stammzell- und organoidbasierten Studien8 ist die Nachfrage nach Biomaterialien mit dynamisch-mechanischen Eigenschaften und Integrin-ähnlichen Adhäsionsstellen oder Gerüsten mit kontrollierter Abbaubarkeitgestiegen 7,9. Diese Attribute können durch den strategischen Einsatz biofunktionalisierter SAPs effektiv abgestimmt werden.
SAPs sind kurze Sequenzen von Aminosäuren mit der inhärenten Fähigkeit, sich spontan in wohldefinierten Strukturen zu organisieren10. Diese Peptide enthalten häufig abwechselnd hydrophobe und hydrophile Reste, die ihre Selbstorganisation durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatischer Wechselwirkungen und hydrophober Effekte, vorantreiben11,12. Der Selbstorganisationsprozess dieser Peptide wird in erster Linie durch die Notwendigkeit angetrieben, die freie Energie des Systems zu minimieren. In einer wässrigen Umgebung neigen die hydrophoben Rückstände dazu, sich zu gruppieren, um ihre Exposition gegenüber Wasser zu minimieren, während die hydrophilen Rückstände mit den umgebenden Wassermolekülen interagieren. Dieses Phänomen führt zur Bildung verschiedener Nanostrukturen. In diesem Fall bilden ultrakurze selbstorganisierende Peptide Nanofasern mit Eigenschaften, die von der Peptidsequenz und den Umweltbedingungen abhängen 2,12,13,14,15,16. Diese Peptide nehmen eine β-Wind-Konformation an, bei der sich einzelne Peptidstränge parallel oder antiparallel zueinander ausrichten und durch Wasserstoffbrückenbrücken stabilisiert werden (Abbildung 1). Das Vorhandensein positiver Ionen beschleunigt die Selbstorganisationsprozesse, die zur Bildung von Nanofasern führen.
Es wurde festgestellt, dass Peptid-Nanofasern eine angeborene Fähigkeit besitzen, erhebliche Mengen an Wasser einzuschließen. Diese Eigenschaft erleichtert die Erzeugung eines Hydrogels, das sich anschließend als biokompatibler und biologisch abbaubarer dreidimensionaler Raum manifestiert, der der Zellproliferation und dem Zellwachstum förderlich ist. Diese selbstorganisierenden Peptid-Nanofasern ahmen die topographischen Merkmale, die der natürlichen Umgebung der extrazellulären Matrix (ECM) innewohnen, auf komplexe Weisenach 1. Diese Ähnlichkeit stattet die Zellen mit einer Umgebung aus, die ihren physiologischen Lebensraum imitiert, was die optimalen Zellaktivitäten weiter fördert17. Darüber hinaus ermöglicht die diesen Peptiden innewohnende Vielseitigkeit ein hohes Maß an Abstimmbarkeit4. Diese Anpassungsfähigkeit ermöglicht Änderungen der Eigenschaften der Matrix, wie z. B. Steifigkeit, Gelierungskinetik und Porosität. Diese Anpassungen werden durch Modifikationen an der Peptidsequenz erreicht. Folglich haben sich selbstorganisierende Peptide (SAPs) zu zentralen Komponenten in der modernen Biomaterialwissenschaft entwickelt und werden häufig als Gerüste für die Geweberegeneration und Zellkultur verwendet13,17.
Einer der entscheidenden Vorteile von selbstorganisierenden Peptiden ist ihre Fähigkeit, auf molekularer Ebene leicht synthetisiert und modifiziert zu werden. Dieser Vorteil ermöglicht den Einbau spezifischer funktioneller Gruppen oder bioaktiver Motive in die Peptidsequenz, was das Design von Peptiden mit maßgeschneiderten Eigenschaften und Funktionalitäten ermöglicht 18,19,20 (Abbildung 1B). So können beispielsweise biofunktionalisierte SAPs so gestaltet werden, dass sie die EZM nachahmen und die Differenzierung mit Hilfe des RGD-Peptidsfördern 19,21. Es wurde auch berichtet, dass das Peptid Ben-IKVAV aufgrund seiner ligandenspezifischen Motity die Expression neuronaler Marker signifikant erhöht22. Diese Peptide können auch so verändert werden, dass sie bioaktive Moleküle anzeigen, wie z. B. Integrin-bindende Peptide, um das Überleben der Zellen zu verbessern23. Schließlich wurden weitere biofunktionalisierte SAPs entwickelt, um die Angiogenese zu fördern, indem die IKVAV- und YIGSR-Motive in ihre Strukturen aufgenommenwurden 24.
Biofunktionalisierte SAPs, über die in einer früheren Veröffentlichung berichtet wurde, zeigen, dass die Selbstorganisation weiter modifiziert werden kann, indem das naive Peptid einbezogen wird, von dem das biofunktionalisierte SAP abgeleitet wurde25. Diese SAP-Mischungen können auch eine breite Palette von SAP-Formulierungen liefern, die sich in ihrer biochemischen Aktivität und ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften unterscheiden. Zum Beispiel ist das amphiphile Peptid IIFK ein ultrakurzes SAP, das einer Biofunktionalisierung mit verschiedenen Motiven standhalten kann, beispielhaft durch den Einbau des IKVAV-Motivs (Abbildung 1B). Beide Peptide können Nanofasern bilden, sowohl allein als auch kombiniert. Jede Formulierung führt zu Hydrogelen mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften (Abbildung 2)
Aufgrund der umfangreichen Palette potenzieller Permutationen und Alternativen, die sich aus der Biofunktionalisierung von SAPs ergeben, besteht jedoch die Notwendigkeit, eine schnelle und kostengünstige Option für Organoidtests bereitzustellen. Ein Kandidat für eine solche intensive und kostengünstige Organoid-Evaluierung ist die SW1222-Zelllinie, die aus dem humanen kolorektalen Adenokarzinom gewonnen wird26,27. SW1222-Zellen besitzen Eigenschaften, die ihre Aggregation zu 3D-Strukturen ermöglichen, die Organoiden ähneln, was sie zu einem idealen Modell für die Untersuchung der Gewebeentwicklung und Anwendungen in der regenerativen Medizin macht. SW1222-Zellen wurden aufgrund ihrer intrinsischen Überexpression des LGR5-Gens als in der Lage identifiziert, Organoide zu erzeugen27. Die Bildung von Organoiden aus einzelnen LGR5+-Stammzellen wurde bereits überzeugend nachgewiesen, ebenso wie die Neigung von SW1222-Zellen, morphologische Eigenschaften eines Darmkrebs-Organoidszu erreichen 28.
In diesem Methodenpapier stellen wir detaillierte Protokolle zur Bewertung und Charakterisierung der Auswirkungen verschiedener biofunktioneller Peptide auf die Zelladhäsion und Lumenbildung anhand von SW1222-Zellen vor (Abbildung 3). Durch die Bereitstellung von Schritt-für-Schritt-Verfahren und bildgebenden Analysemethoden hoffen wir, wertvolle Einblicke in die Biofabrikation von Organoiden und die Bewertung vereinfachter SAP-Matrizen für die Organoidkultur zu bieten.
Das enorme Potenzial von SAPs in der biomedizinischen Forschung wird durch ihre Formbarkeit und Anpassungsfähigkeit durch Biofunktionalisierung unterstrichen. Bei einer so umfangreichen Palette von Permutationen ergibt sich die Herausforderung, die vielversprechendsten Konfigurationen für spezifische Anwendungen, insbesondere in der Organoidforschung, effizient zu testen und zu bestimmen. Eine schnelle und kostengünstige Lösung ist von größter Bedeutung. Die SW1222-Zelllinie, die aus dem humanen kolorektalen Adenok…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der King Abdullah University of Science and Technology finanziell unterstützt. Die Autoren würdigen den Seed Fund Grant der KAUST und den KAUST-Innovationsfonds, die von der KAUST-Abteilung für Innovation und wirtschaftliche Entwicklung vergeben wurden. Die Autoren danken den KAUST Bioscience and Imaging Core Labs für die Unterstützung bei der biologischen Charakterisierung und den mikroskopischen Analysen.
1x PBS | Gibco | 14190144 | |
6-well plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-83 | |
10x PBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 70011044 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | |
24-well plate, tissue culture treated | Corning | 09-761-146 | |
96-well black plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-565 | |
alamarBlue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1025 | |
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab40839 | Secondary used: anti-rabbit Dylight 633 |
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab16505 | Secondary used: anti-rabbit Alexa 488 |
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal | Abcam | ab190085 | Secondary used: anti-goat Alexa 488 |
BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cellpose 2.0 | NA | NA | Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose |
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan | ZEISS | LSM 880 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11055 | |
Glycine | Cytiva | GE17-1323-01 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633 | Invitrogen | 35562 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS) | Gibco | 16140071 | |
ImageJ 1.54f | NIH | NA | |
IMDM | Gibco | 12440079 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free | Corning | 356255 | Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix. |
Microscope, brightfield | |||
Microscope, EVOS | Thermo Scientific | EVOS M7000 | |
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154 | OriginLab Corp | NA | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
Round Cover Slip, 10 mm diameter | VWR | 631-0170 | |
Scanning Electron Microscope | Thermo Fisher – FEI | TENEO VS | |
Sterile 30 μm strainer | Sysmex | 04-004-2326 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | |
SW1222 cell line | ECACC | 12022910 | |
Triton x-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure water | Invitrogen | 10977015 |