Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1
Summary
Los ensayos químicos rápidos y precisos para detectar inhibidores específicos son una herramienta importante en el arsenal de desarrollo de fármacos. Aquí, presentamos un ensayo químico escalable de acetil-clic para medir la inhibición de la actividad de acetilación de HAT1.
Abstract
HAT1, también conocida como histona acetiltransferasa 1, desempeña un papel crucial en la síntesis de cromatina al estabilizar y acetilar el H4 naciente antes del ensamblaje de nucleosomas. Es necesario para el crecimiento tumoral en varios sistemas, lo que lo convierte en un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer. Para facilitar la identificación de compuestos que pueden inhibir la actividad enzimática de HAT1, hemos ideado un ensayo de clic acetil para un cribado rápido. En este sencillo ensayo, empleamos HAT1/Rbap46 recombinante, que se purifica a partir de células humanas activadas. El método utiliza el análogo de acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) en un enfoque de química de clic. Esto implica la transferencia enzimática de un mango alquino a través de una reacción de acilación dependiente de HAT1 a un péptido N-terminal H4 biotinilado. A continuación, el péptido capturado se inmoviliza en placas de neutravidina, seguido de una funcionalización química con biotina-azida. Posteriormente, se emplea el reclutamiento de estreptavidina-peroxidasa para oxidar el rojo amplex, lo que da como resultado una salida fluorescente cuantitativa. Mediante la introducción de inhibidores químicos durante la reacción de acilación, podemos cuantificar la inhibición enzimática en función de una reducción de la señal de fluorescencia. Es importante destacar que esta reacción es escalable, lo que permite un cribado de alto rendimiento de posibles inhibidores de la actividad enzimática de HAT1.
Introduction
Entre las numerosas acetiltransferasas eucariotas, HAT1 fue la histona acetiltransferasa inicial que se aisló 1,2,3. Investigaciones posteriores han establecido firmemente su papel fundamental en la replicación de la cromatina, particularmente en la síntesis de nuevos nucleosomas durante la faseS 4. Nuestros esfuerzos de investigación condujeron al reconocimiento de que HAT1 está altamente estimulado por el tratamiento con factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células mamarias5. Además, ha salido a la luz que HAT1 es necesaria para la rápida proliferación celular y la formación de tumores in vivo 6,7,8,9. Los datos indican que HAT1 es fundamental en la coordinación de los procesos anabólicos y epigenéticos para la división celular, impulsando el crecimiento tumoral.
HAT1 diacetila la cola aminoterminal de la histona H4 en las lisinas 5 y 12 en complejo con la proteína chaperona Rbap46, que se une a la histona y presenta el aminoterminal a HAT1. Los tetrámeros de histonas o disomas10, junto con HAT1/Rbap46 y otras chaperonas de histonas11, se importan al núcleo. A continuación, se liberan histonas para depositarlas en la horquilla de replicación u otros sitios para apoyar la activación o represión de genes. La función de la marca de diacetilación HAT1 en la histona H4 no se comprende completamente. Es probable que se elimine rápidamente en un lapso de 15 a 30 minutos por la acción de las histonas desacetilasas 12,13,14,15 después de que H4 se inserta en la cromatina. Por lo tanto, la marca de diacetilación HAT1 no se propaga en la cromatina y puede no cumplir un verdadero papel epigenético, aunque se ha postulado un papel en el reclutamiento de enzimas modificadoras de la cromatina a la cromatinanaciente 12. Además, HAT1 no acetilla directamente la cromatina; Su actividad se restringe a las histonas solubles.
El desarrollo de inhibidores de la acetiltransferasa de histonas de moléculas pequeñas se ha visto obstaculizado por ensayos inespecíficos y de bajo rendimiento, lo que a menudo resulta en la generación de compuestos biológicamente reactivos16,17. El ensayo de referencia para medir las actividades de la acetiltransferasa requiere el uso de 3-H-acetil-coA, lo que limita el rendimiento y requiere radiación. No obstante, recientemente, se han descrito y confirmado inhibidores de la acetiltransferasa de moléculas pequeñas específicos y muy potentes dirigidos a CBP/p30018 y KAT6A/B19,20 mediante el uso de 3-H-acetil-CoA. De cara al futuro, se están diseñando ensayos mejorados para lograr un mejor rendimiento y evitar riesgos de laboratorio.
Los avances recientes en el monitoreo de la acetilación21 han utilizado la química de clic para permitir el monitoreo de reacciones enzimáticas. Hay una variedad de precursores habilitados para clics a los que se puede acceder por rutas sintéticas simples o disponibles para su compra que se pueden incorporar en reacciones enzimáticas. Estas reacciones se llevan a cabo típicamente en sistemas recombinantes, aunque los ensayos basados en células también son factibles22. La ventaja de los cofactores y sustratos habilitados para clic es que el cribado puede medir directamente la actividad enzimática sin necesidad de sistemas de lectura acoplados que a menudo se ven perturbados por los compuestos de cribado y requieren pasos de manipulación adicionales. Esto permite tratamientos con inhibidores solo durante la etapa enzimática, mientras que todas las etapas posteriores de funcionalización y detección se llevan a cabo después de un lavado extenso para eliminar los compuestos, lo que limita la posibilidad de que se produzcan interferencias en el ensayo. Estas ventajas hacen que el diseño de los ensayos habilitados para clic sea preferible a los ensayos acoplados que comúnmente se basan en la detección de coenzima A libre.
Una consideración importante es la aceptación de los cofactores habilitados para hacer clic en el sitio activo de la enzima. Es posible que los cofactores habilitados para clics existentes no sean totalmente compatibles con el sitio activo optimizado para el cofactor nativo. La información estructural y el modelado se pueden utilizar para diseñar sustituciones de aminoácidos para ampliar el sitio activo e incorporar sustratos alterados23. Esto puede permitir un cribado con una cinética enzimática mejorada y niveles más bajos de sustrato y enzimas. El inconveniente de este enfoque es que las bolsas catalíticas alteradas pueden no identificar los inhibidores que interactúan fuertemente con la enzima nativa. En última instancia, se requiere una combinación de enfoques para identificar y validar posibles inhibidores enzimáticos.
Aquí, describimos un método desarrollado para purificar y ensayar la actividad de la enzima HAT1 utilizando el cofactor clic 4-pentinoil-CoA24. Este ensayo (Figura 1) utiliza la secuencia de la enzima nativa en complejo con su proteína asociada requerida Rbap46, que se ha demostrado que aumenta la actividad enzimática. La purificación de la enzima a partir de células humanas permite la activación enzimática en el celulo, lo que puede preservar modificaciones postraduccionales estimulantes importantes para la actividad enzimática completa. El diseño y la optimización de ensayos enzimáticos recombinantes para cribados químicos de alto rendimiento se han utilizado con éxito para identificar y caracterizar inhibidores de moléculas pequeñas HAT1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la última década, la química de clic se volvió prominente20, permitiendo el diseño preciso de estructuras químicas que interactúan. En este contexto, diversas conexiones covalentes bioortogonales21 han surgido como opciones prometedoras para la formación de complejos en su entorno natural. La química de clic emplea pares de grupos funcionales que exhiben reacciones rápidas y selectivas, comúnmente conocidas como “reacciones de clic”. Estas reacciones se produc…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a George Zheng por proporcionar H4K12CoA. Agradecemos a los miembros de Gruber Lab por sus útiles discusiones y comentarios. Agradecemos el apoyo de los NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) y la Fundación V (V2022-022).
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
Referenzen
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