Высокопроизводительный метод количественной оценки образования внеклеточных ловушек нейтрофилов в нейтрофилах человека в режиме реального времени
Summary
Мы представляем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) с использованием системы анализа живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны.
Abstract
Нейтрофилы – это клетки миелоидной линии, которые составляют важнейшую часть врожденной иммунной системы. Последнее десятилетие выявило дополнительные ключевые роли, которые нейтрофилы играют в патогенезе рака, аутоиммунных заболеваний и различных острых и хронических воспалительных состояний, способствуя инициированию и сохранению иммунной дисрегуляции с помощью многочисленных механизмов, включая образование внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ), которые являются структурами, имеющими решающее значение для противомикробной защиты. Ограниченность методов количественной оценки образования НВЛ объективным, воспроизводимым и эффективным способом ограничила нашу способность к дальнейшему пониманию роли нейтрофилов в здоровье и болезнях. Мы описываем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения нейтрофилов, претерпевающих образование НВЛ, в режиме реального времени, с использованием платформы визуализации живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны, с использованием двух разных красителей ДНК для визуализации внутриклеточной и внеклеточной ДНК. Эта методика может помочь оценить физиологию нейтрофилов и протестировать молекулы, которые могут быть нацелены на образование НВЛ.
Introduction
Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) представляют собой паутиноподобные структуры хроматина, выдавливаемые из нейтрофилов в ответ на различные воспалительные стимулы. НВЛ состоят из ДНК, гистонов и различных антимикробных белков/пептидов, которые улавливают и убивают инфекционные патогены и вызывают воспалительные реакции1.
В то время как НВЛ полезны для защиты организма от патогенов, они привлекли внимание как потенциальный фактор различных аутоиммунных заболеваний2, тромбоза3, метаболических заболеваний4 и метастатического роста рака5. Таким образом, ингибирование образования НВЛ является потенциальным терапевтическим вариантом для этих заболеваний. Однако, несмотря на то, что некоторые многообещающие молекулы, нацеленные на НВЛ, находятся в разработке6, до сих пор не существует одобренной терапии, которая бы конкретно влияла на этот механизм. Это, по крайней мере частично, объясняется отсутствием объективных, непредвзятых, воспроизводимых и высокопроизводительных методов количественной оценки для формирования НВЛ.
Мы разработали и описали новый метод с использованием двухцветной платформы визуализации живых клеток 7,8. Покадровые изображения нейтрофилов, окрашенных мембранопроницаемым ядерным красителем и мембранонепроницаемым красителем ДНК, анализируются программным обеспечением, и количество нейтрофилов до и после образования НВЛ подсчитывается в нескольких временных точках. Поскольку целостность плазматической мембраны теряется при образовании НВЛ в результате регуляции PKCα-опосредованного ламина B и CDK4/6-опосредованного ламина A/C9, нейтрофилы, образующие NET, окрашиваются мембранонепроницаемым красителем ДНК, в то время как здоровые нейтрофилы — нет. Этот метод преодолевает проблемы, связанные с ранее описанными методами количественной оценки образования НВЛ, и обеспечивает непредвзятое, высокопроизводительное, воспроизводимое и точное количественное определение НВЛ в автоматическом режиме.
Protocol
Representative Results
Discussion
Современные методы количественного определения НВЛ ex vivo имеют ряд недостатков, которые ограничивают нашу способность изучать нейтрофилы, НВЛ и потенциальные терапевтические мишени непредвзятым и высокопроизводительнымспособом. Например, прямой …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Секцию световой визуализации Управления науки и технологий Национального института артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи Национальных институтов здравоохранения. Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований Национального института артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи Национальных институтов здоровья (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
Referenzen
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
