Etablierung eines murinen Pulpa-Expositionsmodells mit einem neuartigen Mundknebel für die Pulpitisforschung

Die experimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan genehmigt (WCHSIRB-D-2021-125). Adulte C57BL/6-Mäuse wurden von der Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China, gewonnen. Die gesamte Krone des ersten Backenzahns des Oberkiefers bricht 21 Tage nach der Geburt durch. Mäuse für die Operation sollten älter als 21 Tage sein und eine normale Vitalitätaufweisen 11. Hier wurden 6 bis 8 Wochen alte Mäuse für die Modellierung verwendet. Abbildung 1 ist ein Flussdiagramm, das das verwendete Protokoll zeigt. 1. Präoperative Vorbereitung (Abbildung 2) Besorgen Sie sich folgende Instrumente: Stereoskopisches Mikroskop, Fixierplatte, medizinisches Klebeband, Mundknebel, minimalinvasiver Zahnfräser mit einem Durchmesser von 0,6 mm, zahnärztliches Hochgeschwindigkeits-Zahnhandstück, 8# C+ Feile, Heizkissen, 1 mL Spritze, steriler Wattebausch, Augenzange. Besorgen Sie sich die folgenden Medikamente: Anästhesiemischung, Veterinärsalbe. 2. Vorbereitung des Mundknebels Wiegen und betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion einer Anästhesie-Mix-Lösung (10 % Ketaminhydrochlorid + 5 % Xylazin + 85 % sterile isotonische Kochsalzlösung) bei 0,007 ml/g Körpergewicht und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie durch die Zehenkneifmethode. Tragen Sie eine Augenschmiersalbe auf die Augen auf, um Augenverletzungen durch Austrocknung während der Operation zu vermeiden.HINWEIS: Medizinische Hüte, Masken, Handschuhe und Overalls sowie andere grundlegende Schutzmaßnahmen sind erforderlich. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Operationsumgebung als auch die Mauskammer sauber und sicher sind. Ein Wärmekissen zur thermischen Unterstützung während des gesamten Eingriffs ist erforderlich. Bereiten Sie den Mundknebel wie unten beschrieben vor (Abbildung 3).Beziehen Sie folgende Materialien: Kieferorthopädischer Bogendraht mit einem Durchmesser von 8 μm, eine junge Schlaufenbiegezange, ein schwerer Drahtschneider, ein Markierungsstift, eine Gummikappe mit einer Länge von 3 mm und einem Querschnittsdurchmesser von 1 mm. Zuerst richten Sie den Bogendraht mit der linken Hand zur Fixierung aus und Daumen, Zeigefinger der rechten Hand beugen sich leicht gegen den Drahtbogen. Wiederholen Sie diese Aktion mehrmals, um das Biegen auf den richtigen dreidimensionalen Winkel zu erleichtern. Biegen Sie mit der Yong-Schlaufenbiegezange die Oberkante (Bild 3G, a-i) des Trapezes (Bild 3C, a-l-k-b) etwa 8 mm lang in der Mitte des Bugdrahtes. Stellen Sie sicher, dass sich Punkt a (Abbildung 3) am Rand des Zangeschnabels befindet. Halten Sie die Zange mit der linken Hand fest, klemmen Sie mit dem rechten Daumen und Zeigefinger das freie Ende des Bügeldrahtes fest und biegen Sie den Bügeldraht von Punkt a aus in einen Winkel von etwa 120°. Duplizieren Sie die vorherige Aktion bei Punkt i (Abbildung 3G). Überprüfen Sie, ob sich der Bogen auf einer Ebene befindet, indem Sie ihn ohne Aufhebeln auf einen horizontalen Tisch legen. Lassen Sie auf jeder Seite etwa 9 mm Länge (Abbildung 3D, a-b, l-k) und biegen Sie das freie Ende in einen 75°-Winkel, indem Sie die gleiche Vorgehensweise wie in Schritt 2.2.4 anwenden, wobei Sie darauf achten, dass sich jede Kante auf einer Ebene befindet. Biege diesen spitzen Winkel mit der Spitze des Zangeschnabels. Finde den Punkt c etwa 5 mm von Punkt b entfernt. Befolgen Sie die gleiche Fähigkeit, um einen 105°-Winkel auf Punkt c zu biegen. Biegen Sie einen weiteren 105°-Winkel an Punkt d 5 mm von Punkt c entfernt. Lassen Sie etwa 4,5 mm von Punkt d entfernt und suchen Sie Punkt e. Biegen Sie das freie Ende an Punkt e so, dass es einen Winkel von etwa 100 -105° bildet (Abbildung 3E).HINWEIS: Die 6-8 Wochen alten C57-Mäuse, die wir verwendet haben, wogen etwa 20 g. Der Abstand von 5 mm könnte nicht nur den Ober- und Unterkiefer der Mäuse einklemmen, ohne sich zu bewegen, sondern würde auch nicht auf die Haut der Mäuse drücken und Beschwerden verursachen. Wenn andere Arten oder Alter von Mäusen verwendet werden, passen Sie bitte die Länge der c-d- und i-h-Teile an die tatsächliche Situation an (Abbildung 3E, G). Beugen Sie einen zusätzlichen Zungenspatel für den Unterkieferteil (Abbildung 3G, j-i-h-g). Doppelte Biegeschritte des a-b-c-Teils auf dem l-k-j-Teil. Klemmen Sie i-k- und k-j-Teile gleichzeitig und biegen Sie das freie Ende an Punkt j, um es senkrecht zur i-k-j-Ebene zu machen. Klemmpunkt i, der 5 mm von Punkt j entfernt ist, biegen Sie das freie Ende so, dass es sowohl zur i-k-j-Ebene als auch zum c-d-Teil parallel ist (Abbildung 3H). Lassen Sie 5 mm Länge von Punkt i, biegen Sie den Bogen an Punkt h vertikal zum i-h-Teil und parallel zur j-i-h-Ebene. Ermitteln Sie Punkt g bei 5 mm von Punkt h. Klemmen Sie die Ebene j-i-h-g und biegen Sie das freie Ende symmetrisch zum k-j-Teil. Dann sollte das freie Ende nach dem Punkt f symmetrisch zum freien Ende des Punktes e sein (Abbildung 3H). Setzen Sie Gummikappen auf das freie Ende (Abbildung 3F). 3. Immobilisierung Fixieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Fixierplatte, wobei die Gliedmaßen mit Hautband gesichert sind. Die freien Enden des Mundknebels mit Daumen und Zeigefinger zusammendrücken. Fixieren Sie die vorderen Schneidezähne der Maus in der trapezförmigen Rille von zwei Armen. Stellen Sie sicher, dass der Arm mit dem Zungenspatel für den Unterkiefer bestimmt ist. Passen Sie den Mundknebel an, um sicherzustellen, dass die Zunge der Maus immobilisiert, aber nicht ischämisch ist. 4. Beurteilung der Zähne Stellen Sie sicher, dass der erste Backenzahn des Oberkiefers für die Operation frei von Karies, Traumata und Odontogenese ist. Stellen Sie sicher, dass sich keine Rötungen, Schwellungen oder Fisteln auf der umgebenden Gingiva befinden. Stellen Sie sicher, dass die gegenüberliegenden Zähne gesund sind und als gesunde Kontrollgruppe zur Verfügung stehen. 5. Exposition der Pulpa Bohren Sie mit Zahnfräser an der okklusalen Seite des ersten Molaren des Oberkiefers mit einer Drehzahl von 20.000 U/min. Stellen Sie sicher, dass der Zahnschmelz entfernt wird. Halten Sie die Operation mit dem zahnärztlichen Handstück nur in einer flachen Dentinschicht, um eine übermäßige thermische Stimulation des Zahnpulpagewebeszu vermeiden 12. Verhindern Sie gleichzeitig eine Überhitzung, indem Sie während der Operation alle 3 Minuten mit einer Spritze normale Kochsalzlösung auf den Zahn tropfen. Legen Sie eine 8# oder 10# C+ Feile auf die unterste Position der Bohrgrube und stechen Sie durch das letzte Dentin, um die Pulpakammer freizulegen. Es wird ein offensichtliches Sturzgefühl sein, wenn das lokale Dentin gründlich entfernt wird. Nicht zu tief bohren, da sonst Zahnpulpagewebe aus der Pulpakammer herausgeholt werden könnte. Reinigen Sie die Fragmente um den Zahn herum. Nehmen Sie den Mundknebel ab; Die Operation ist abgeschlossen. Verwenden Sie den gegenüberliegenden ersten Molaren des Oberkiefers als Kontrolle ohne Operation. 6. Nachsorge Verabreichen Sie nach der Operation Carprofen (5 mg/kg) subkutan und legen Sie die Maus bis zur Genesung aus der Narkose in Bauchlage auf das chemothermische Heizkissen. Füttern Sie die Mäuse und stellen Sie Trinkwasser zur Verfügung. Der Wiederherstellungsprozess sollte überwacht werden. Keine anderen Tiere sollten sich in derselben Kammer befinden, bis sich die Maus vollständig erholt hat. 7. Probenentnahme und -lagerung Euthanasieren Sie die Maus mit zervikaler Luxation unter tiefer Betäubung 24 Stunden nach der Operation oder zu einem anderen Zeitpunkt gemäß Experiment9. Schneiden Sie die Skelettmuskulatur, die am Oberkiefer und am Jochbein befestigt ist, mit einer Augenschere durch. Skelett, Stirnbein und Weichgewebe entfernen und die Lamina gnathostegit mit den Oberkiefermolaren herausnehmen.HINWEIS: Laut He et al. wird empfohlen, dass die Pulpitis-Probe weniger als 72 Stunden nach der Operation entnommen werden sollte, um eine ausgedehnte Nekrose im Zahnpulpagewebe zu vermeiden13. Teilen Sie das Gnathostegit sagittal in zwei Hälften und lagern Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, bei 4 °C für die 24h-Fixierung. 8. Histologische Analyse Waschen Sie das Gewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entkalken Sie es in täglich gewechselter Entkalkungslösung von 5 % EDTA und 4 % Saccharose in PBS, pH 7,4, bei 4 °C für 2-4 Wochen10. Betten Sie den 1/2 Gnathostegit in Paraffin ein und stellen Sie sicher, dass sich das sagittale Gesicht ohne Zähne am unteren Rand der Gewebekassetten befindet. Schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Paraffinmikrotom in 5 μm dicke Scheiben. Passen Sie den Winkel des Paraffinblocks entsprechend der unter dem Mikroskop beobachteten proximalen, distalen, oberen und unteren Beziehung an, um sicherzustellen, dass die gesamte Kronenpulpa und die Perforation des ersten Molaren durchtrennt werden können.