Ein rein humanes Leberkultursystem für Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung
Summary
Jüngste technische Fortschritte ermöglichten die skalierte Produktion einer In-vitro-Plattform für Anwendungen im Bereich des Arzneimittelstoffwechsels und der Toxizität. Ein rein humanes 2D+ Lebersystem (TV2D+) liefert physiologisch relevante Ergebnisse mit herkömmlichen zweidimensionalen Kulturmethoden. Dieses Protokoll unterstützt Endbenutzer bei der Einrichtung, Wartung und Anwendung des Systems.
Abstract
Die Suche nach einem langfristigen, humanrelevanten Kulturmodell für primäre humane Hepatozyten (PHHs) für pharmakologische und toxikologische Studien stellt nach wie vor eine Herausforderung dar. Derzeitige In-vitro-Modellplattformen sind oft unpraktisch und komplex, es fehlt ihnen an phänotypischer Stabilität im Laufe der Zeit und sie unterstützen nicht mehrere PHH-Chargen, da es ihnen an experimenteller Reproduzierbarkeit und Flexibilität mangelt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für das Auftauen, Plattieren und Warten eines rein menschlichen 2D+-Lebersystems (TV2D+) zur Verfügung, das die Vorteile von zweidimensionalen (2D) Standardkulturtechniken und -geräten nutzt und gleichzeitig die Langlebigkeit und phänotypische Stabilität im Laufe der Zeit beibehält, die typischerweise mit komplexeren dreidimensionalen (3D) Systemen einhergehen. Die Ergebnisse zeigen die Anheftung und prozentuale Beschichtbarkeit in TV2D+ in Abhängigkeit von der PHH-Aussaatdichte sowie eine stabile Funktionalität für mindestens 2 Wochen in Kultur. Eine Reihe von PHH-Aussaatdichten wird bewertet, um eine erfolgreiche Langzeitkultur zu erreichen. Wenn sie richtig etabliert sind, organisieren sich die PHHs in TV2D+ in Hepatozytenkolonien, exprimieren einen Leber-spezifischen Marker und erhalten die Lebensfähigkeit, die architektonische Integrität und physiologisch relevante Konzentrationen von Albumin und Harnstoff. Diese einzigartige Kombination von Eigenschaften macht das TV2D+ System zu einem geeigneten Lebermodell für eine Vielzahl von pharmakologischen und toxikologischen Anwendungen.
Introduction
Die Vorhersage der therapeutischen Sicherheit und Wirksamkeit ist ein wichtiger Bestandteil der präklinischen Arzneimittelentwicklung. Herkömmliche präklinische In-vitro-Lebermodelle sind jedoch nur begrenzt in der Lage, die zelluläre Mikroumgebung der Leber genau nachzuahmen und die Funktionalität und Morphologie der Hepatozyten im Laufe der Zeit aufrechtzuerhalten. Es besteht ein Bedarf an Modellen, die eine stabile metabolische Kompetenz für mehr als 1 Woche bieten, um Verbindungen mit langsamem Umsatz zu bewerten oder Ergebnisse im Zusammenhang mit subakuter oder chronischer Exposition zu untersuchen. In-vivo-Tierversuche sind oft nicht in der Lage, die Wirksamkeit und das Risiko von Arzneimitteln vorherzusagen, da translationale Speziesunterschiede in den menschlichen Leberclearance-Mechanismen bestehen1. Derzeitige 2-dimensionale (2D) In-vitro-Lebermodelle, wie z. B. traditionelle primäre humane Hepatozyten-Monokulturen (PHH) oder Sandwich-Kulturen, weisen in der Kultur keine phänotypische Stabilität und Langlebigkeit auf, was im Laufe der Zeit zum Verlust wichtiger hepatozellulärer Funktionen und architektonischer Integrität führt2. Eine alternative Methode beinhaltet die Bildung von 3-dimensionalen (3D) Hepatozyten-Sphäroiden, die eine relevantere Mikroumgebung als eine 2D-Kultur bieten. Diese Methode ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Rohstoffen, die Auswahl der PHH-Spender-Chargen, die Reproduzierbarkeit und den Verlust der Lebensfähigkeit mit zunehmender Sphäroidgrößebegrenzt 3,4,5,6. Es wurden multizelluläre Plattformen eingeführt, bei denen PHHs mit Feederzellen auf Platten mit fester Größe, mikrostrukturierten Platten ausgesät werden. Obwohl diese Modelle längere Kulturzeiten ermöglichen können, können nicht-menschliche Feederzellen, die auf diesen Plattformen verwendet werden, die experimentellen Ergebnisse verändern und ihre Anwendung aufgrund ihres angeborenen Hintergrundbeitrags zur Wirkstoffclearance und zu metabolischen Profilen einschränken 1,7. Das TruVivo All-Human 2D+ Lebersystem (TV2D+), das kürzlich in Weaver et al.8 beschrieben wurde, wurde entwickelt, um einige der Einschränkungen traditioneller, Co-Kultur- und 3D-Kulturmethoden von PHHs zu überwinden. Die Nicht-Leber-Feeder-Zellen reduzieren die Unterschiede zwischen den Spezies im Stoffwechsel und in der parakrinen Produktion und bieten die notwendige Unterstützung für primäre Hepatozyten in einer reproduzierbaren, robusten Weise, die von entsprechenden nicht-parenchymalen Leberzellen aus einer einzigen Spendercharge aufgrund von Einschränkungen in Expansion, Phänotyp und Leistung nicht bereitgestellt werden kann. Die ausgewählten Feeder-Zellen konnten vor der Verwendung konsequent expandiert werden und es fehlte die Notwendigkeit einer Transformation oder Differenzierung. Wie von Glicklis et al.4 und Khetani et al.5 beschrieben, haben 3D-Kulturmodelle wie Hepatozyten-Sphäroide aufgrund der Variabilität der Spender und der Aufrechterhaltung der Konsistenz der Sphäroidgröße Schwierigkeiten mit der Reproduzierbarkeit, was sich auf die Nährstoffdiffusion in Sphäroiden über 200 μm auswirkt, was zu einer verminderten Lebensfähigkeit und Funktionalität führt. Wie bei der 3D-Sphäroidbildung beruht das TV2D+-System auf der Selbstorganisation von PHHs. Die gebildeten PHH-Kolonien sind jedoch über die Oberfläche des Bohrlochs in einer Einzelzelltiefe verteilt, anstatt zu einem einzigen Aggregat verdichtet zu werden. Diese Kulturmethode kann nützlich sein, um die Variabilität der Spender zu berücksichtigen, so dass PHHs plattiert und kultiviert werden können und die grundlegende Funktionalität bei verschiedenen Aussaatdichten aufrechterhalten werden können. Das TV2D+-System kann auch die Robustheit der Benutzerhandhabung aufgrund von Verlusten während der Manipulation oder spezieller Ausrüstung erhöhen, die für die Durchführung einer erweiterten Kultur in 3D-Sphäroiden erforderlich ist.
Das TV2D+-System kombiniert die Standard-2D-Kultur mit der Langlebigkeit und phänotypischen Stabilität, die typischerweise mit 3D-Systemen einhergehen. Das hier beschriebene Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für Benutzer mit grundlegenden Gewebekulturkenntnissen in Laboren, die mit Standardgeräten wie Biosicherheitswerkbänken, Zentrifugen und CO2 -Inkubatoren ausgestattet sind. Jeder Schritt des Prozesses wird detailliert beschrieben, einschließlich der Medienvorbereitung, des Auftauens, der Beschichtung und der Wartung des resultierenden Kultursystems. Das Protokoll enthält auch eine Methode zur Bestimmung der grundlegenden Hepatozytenfunktionalität, Albumin und Harnstoff, sowie eine immunfluoreszierende Bildanalyse zur Bestimmung der PHH-Bindung für die Normalisierung. Wenn sie richtig etabliert sind, organisieren sich die PHHs in TV2D+ in Hepatozytenkolonien, ahmen die native Lebermorphologie nach und halten eine verlängerte Lebensfähigkeit, architektonische Integrität und physiologisch relevante Mengen an Albumin und Harnstoff für mindestens 2 Wochen aufrecht8. Da das System eine Reihe von PHH-Aussaatdichten zulassen kann, kann es nützlich sein, um die Verfügbarkeit von weniger plattierbaren PHH-Chargen zu erhöhen, die wünschenswerte Spendereigenschaften aufweisen. Diese Kombination aus Zugänglichkeit und Funktionalität macht TV2D+ zu einem geeigneten Lebermodell für eine Vielzahl pharmakologischer und toxikologischer Anwendungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Leberkultursystem kann in Laboratorien etabliert werden, die mit Standard-Gewebekulturinstrumenten ausgestattet sind. Das System besteht aus PHHs, die mit Feeder-Zellen kultiviert wurden, und ermöglicht es dem Benutzer, PHHs mindestens zwei Wochen lang mit stabiler Albuminproduktion und Harnstoffsynthese zu kultivieren. Aufgrund der Variabilität der PHH-Spenderchargen werden nur vorgeprüfte und qualifizierte PHHs für die Verwendung im System empfohlen. Obwohl die Anzahl der gebundenen PHHs je nach Spendercharge und Aussaatdichte variiert, bleibt die relative Plattenfähigkeit innerhalb jeder Spendercharge ähnlich. Während empfohlene Aussaatdichten empfohlen werden, deuten die oben genannten Daten darauf hin, dass die Aussaatdichte von Hepatozyten an unterschiedliche experimentelle Bedürfnisse angepasst werden kann. Es sollte jedoch beachtet werden, dass das Seeding einer größeren Anzahl von PHHs möglicherweise keine höheren oder konsistenteren funktionalen Ergebnisse liefert. Die Analyse der ausgewerteten PHH-Chargen ergab den niedrigsten CV für die Albuminproduktion und die Harnstoffsynthese bei niedrigeren Aussaatdichten von 150.000 PHHs/Well und 200.000 PHHs/Well; Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen Albumin und Harnstoff bei irgendeiner Aussaatdichte gefunden. Höhere Aussaatdichten von 250.000 PHHs/Well und 300.000 PHHs/Well zeigen eine stärkere Abnahme von Albumin und Harnstoff über die 14-tägige Kulturperiode. Die inhärente Variabilität der Plattenfähigkeit der Spender kann die Konsistenz der Albuminproduktion und der Harnstoffsynthese bei 250.000 PHHs/Well und 300.000 PHHs/Well für die getesteten Spenderchargen beeinträchtigen. Ähnlich wie bei großen Hepatozyten-Sphäroiden kann die Übersaat von PHHs im TV2D+-System negative Auswirkungen auf die Langzeitkultur und -funktionalität von PHHs haben.
Alle Schritte des Auftauens, der Beschichtung und der Wartung sind entscheidend für eine erfolgreiche Kultur- und Datengenerierung. Es gibt jedoch einige häufige Fehler, die unerfahrene Benutzer vermeiden können. PHHs sind sehr anfällig für Schäden infolge von Temperaturschwankungen, Scherspannungen und Lufteinwirkung 9,10. Beim Auftauen von PHHs sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um längere Auftauzeiten und übermäßiges Pipettieren zu vermeiden. Die Verwendung einer Handgießmethode, eines Timers und des sofortigen Transfers vom Wasserbad auf Eis reduziert diese häufigen Fehler, die die Lebensfähigkeit und Plattenfähigkeit der PHHs beeinträchtigen können. Da Probleme in der Lieferkette immer häufiger auftreten, kann es außerdem schwierig sein, kollagenbeschichtete Platten zu erhalten. Die manuelle Beschichtung von mit Gewebekulturen behandelten Platten mit handelsüblichen Lösungen von Kollagen Typ I (5-10 μg/cm2) kann verwendet werden, um dieses Problem zu lösen. Für eine optimale Leistung und Konsistenz wird jedoch empfohlen, vorbeschichtete Kollagenplatten zu verwenden. Beim Übergang von der reinen Feederzellkultur zur Einführung von PHHs ist es wichtig, ein Austrocknen der Feederzellschicht zu verhindern. Lassen Sie die Feeder-Zellen niemals mit Luft in Berührung kommen. Jede Expositionszeit an der Luft kann zu einer schlechten Qualität der Feeder-Zellschicht führen, was sich negativ auf die Langzeitkultur von PHHs auswirkt. Es empfiehlt sich, eine kleine Menge Restmedium zwischen den Mediumwechseln verbleiben zu lassen. Gelegentlich können PHHs überschüssige Ablagerungen aus der Isolierung enthalten, was die Betrachtung der Morphologie erschweren kann. Um dieses Problem zu lösen, schütteln Sie die Platte vor einem Mediumwechsel und verwenden Sie eine Vakuumaspiration. Wenn Sie schließlich einen Mediumwechsel durchführen, saugen Sie das verbrauchte Medium vorsichtig an und achten Sie darauf, die kultivierten Zellen nicht zu stören. Pipettieren Sie frisches Mediumvolumen an der Seite des Wells, um zu vermeiden, dass Sie direkt auf die Zellschicht pipettieren. Der Benutzer sollte auch die Luftexposition bei jedem Medienwechsel vermeiden, indem er den empfohlenen 3-Well-Wechsel (Abschnitte 3 und 4) verwendet. Zu beachten ist auch, dass ein täglicher Mediumwechsel ideal, aber nicht erforderlich ist.
Obwohl Fluoreszenzmikroskope in den meisten Laboren üblich geworden sind, kann die Software, die für die Durchführung spezifischer Bildanalysen benötigt wird, zusätzliche Kosten verursachen. ImageJ kann kostenlos heruntergeladen werden, was es zu einem leicht zugänglichen Bildanalysewerkzeug macht. Die Schritte im Protokoll bieten eine Grundlage, auf der der Benutzer möglicherweise optimieren muss, insbesondere die Partikelanalyse der DAPI-Färbung; In Ermangelung einer Fluoreszenzbildgebung werden die PHH-Bindungswerte an Tag 14 jedoch auf chargenspezifischen Analysezertifikaten angegeben. Ein schlechter Schwellenwert führt zu einer ungenauen Zählung der DAPI-Partikel. Es wird auch empfohlen, die Oberfläche einzelner DAPI-Partikel zu überprüfen, bevor Sie einen Größenausschluss festlegen. Dies kann erreicht werden, indem Sie das ovale Symbol [Abbildung 2 (1), Kreissymbol unter der Registerkarte Bearbeiten ] verwenden und einen Kreis zeichnen, der das DAPI-Partikel umfasst. Auf der Registerkarte Analysieren kann dann die Fläche des ausgewählten DAPI-Partikels gemessen werden. Bestimmte Messungen können über die Option Messungen festlegen auf der Registerkarte Analysieren ausgewählt werden [Schritt 8.9 und Abbildung 2 (4)].
Derzeitige Methoden zur Kultivierung von PHHs beinhalten die Verwendung von Beschichtungen wie Kollagen-I zur Erhöhung der Zelladhäsion in traditionellen 2-dimensionalen Monokulturen11 oder die Überlagerung mit einer extrazellulären Matrix, wie das murinbasierte Matrigel, eine Technik, die allgemein als “Sandwichkultur” bezeichnet wird12,13,14,15. Während die Sandwich-Kulturtechnik die PHH-Morphologie und -Polarität im Vergleich zur traditionellen Monokultur im Laufe der Zeit verbessert, fehlt es beiden Ansätzen immer noch an langfristiger phänotypischer Stabilität in der Kultur für die meisten plattierbaren Chargen von PHHs. Eine weitere Methode zur Kultivierung von PHHs ist die Herstellung von 3D-Sphäroide. Wie bereits von Glicklis et al.4 erwähnt, kann es jedoch aufgrund der Variabilität der Spender technische Herausforderungen bei der Reproduzierbarkeit der Sphäroidgröße geben. In dem Bestreben, ein physiologisch relevanteres Lebermodell zu erstellen, wurden mehrzellige Modelle entwickelt. Wie von Ware et al.7 beschrieben, ermöglichten murine Fibroblasten und primäre menschliche Lebersinus-Endothelzellen, die von PHHs umgeben waren, mit Hilfe von Mikrostrukturierung längere In-vitro-Kulturzeiten. Die Mikrostrukturierung kann jedoch ein komplexer und zeitaufwändiger Prozess sein, und die nicht-menschlichen Feeder-Zellen können zum Hintergrund von Stoffwechselsignalen beitragen, was den Nutzen dieser Plattform in bestimmten Anwendungen einschränkt. Die Verwendung verschiedener Nicht-Leberzellen, einschließlich dermaler Fibroblasten von Menschen und Ratten sowie Endothelzellen der Rinderaorta als Feederzellen für die Co-Kultur von Hepatozyten hat eine Albuminsekretion und Tight-Junction-Bildung gezeigt, die denen von Kokulturen von Feederzellen aus der Leber ähnelt16. Der Mechanismus der Interaktionen zwischen TV2D+-Nicht-Leber-Feederzellen und den PHHs in Kultur muss jedoch weiter untersucht werden, um den Einfluss auf die Stabilität und Funktionalität der PHHs in diesem System besser zu verstehen. Das zuvor von Weaver et al.8 beschriebene Kultursystem kann PHHs in Leberkolonien bis zu 42 Tage lang erfolgreich kultivieren und dabei ausgedehnte gallenkanalikuläre Netzwerke bilden. Die PHHs, die in diesem System kultiviert wurden, behielten die wichtigsten Leberfunktionen bei, einschließlich der Aktivität von Cytochrom 1A2, 2B6 und 3A4 und der auf Uridine 5′-Diphospho-Glucuronosyltransferase (UGT) basierenden Enzymaktivität, der Metabolitenbildung der Phasen I und II, der Albuminproduktion und der Harnstoffsynthese für mindestens 22 Tage in vitro ohne Matrigel. Dieses Kultursystem erzeugt stabile, physiologisch relevante Ergebnisse, die für pharmakologische und toxikologische Anwendungen leicht an jedes Labor angepasst werden können. Obwohl wichtige PHH-Funktionen im TV2D+-System beibehalten werden, wurden keine direkten Vergleiche mit dem 3D-Sphäroidmodell angestellt. Zukünftige Arbeiten, die dieselben PHH-Donatoren zwischen den Kultursystemen vergleichen, werden sich jedoch als wertvoll erweisen, um die Grenzen und Vorteile beider Methoden zu bestimmen.
Zu den möglichen Anwendungen von TV2D+ gehören die Bewertung der metabolischen Clearance und der Arzneimittelwechselwirkungen von Verbindungen mit geringem Umsatz, arzneimittelinduzierte Leberschäden und die Risikobewertung von Agrochemikalien. Die genaue Vorhersage der hepatischen Clearance von neuen und aufkommenden Medikamenten hängt von einer stabilen und verlängerten PHH-Kultur unter Beibehaltung der wichtigsten hepatozellulären Funktionalität ab, was bei der Bewertung von Verbindungen mit geringem Umsatz eine besondere Herausforderung darstellt. Darüber hinaus sind die Risikobewertung und die chemisch induzierte Lebertoxizität ein großes Gesundheitsproblem, und die derzeitigen Modelle bieten nicht die langfristige Stabilität und Funktionalität in Kultur, um eine potenzielle chronische chemische Toxizität, die als Folge einer akuten Exposition auftreten kann, genau zu bewerten. Gesunde und erkrankte PHHs, die in TV2D+ kultiviert wurden, zeigten charakteristische Unterschiede in der Funktion und Lipiddisposition, die über die Zeit erhalten blieben17. Diese Studien unterstützen TV2D+ als vielversprechendes Werkzeug für eine Vielzahl pharmakologischer und toxikologischer Anwendungen.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mellissa Keller und Wendy Hetman für ihre Unterstützung bei der Manuskript- und Abbildungsprüfung.
Materials
| 0.2 µm PES filter unit | Thermo Fisher Scientific | 565-0020 | User preference |
| 15 mL or 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 352196 or 352070 | User preference |
| Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Other secondary antibodies can work |
| Anti-Cytokeratin 18 antibody | abcam | ab24561 | Necessary using same dilution |
| AOPI | Nexcelom | CS2-0106-5mL | Used for Cellometer counting |
| Biosafety cabinet | Labconoco | 3460801 | User preference |
| Black-walled, clear bottom, 96-well plate | Thermo Fisher Scientific | 165305 | User preference |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall X4R | Capable of speeds up to 400 x g |
| Collagen coated plate, 24-well | Greiner Bio-One | 662950 | Rat tail collagen coating |
| Counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | Used for Cellometer counting |
| Culture medium | LifeNet Health | MED-TCCM | |
| Culture supplement | LifeNet Health | MED-TCSC | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | Contains mounting medium |
| DPBS (-Ca, -Mg) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | User preference |
| Feeder cell supplement | LifeNet Health | MED-TCSA | |
| Feeder cell thawing medium | LifeNet Health | MED-FCTM | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | Equipped with user specific filters |
| Hepatocyte thawing medium | LifeNet Health | MED-HHTM4C-50ML | |
| Human albumin ELISA kit | abcam | ab108788 | Necessary if using same dilution |
| Human feeder cells | LifeNet Health | PHFC24 | |
| Humidified incubator | VWR | 97025-842 | Capable of 5% CO2 |
| IC Fixation buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used |
| ImageJ | National Insitute of Health | Version 1.52a | 1.52a or higher |
| Inverted phase contrast microscope | Olympus | CK40-F100 | User preference |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 20170-022 | User preference |
| Micropipettes (various sizes) | USA Scientific | ErgoOne | User preference |
| Permeabilization buffer (10x) | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | Other permeabilization buffers can work |
| Plate reader | BMG Labtech | CLARIOstar | Capable of reading absorbance 450-640 nm |
| Plating medium | LifeNet Health | MED-TCPM | |
| Plating supplement | LifeNet Health | MED-TCSB | |
| Primary human hepatocytes | LifeNet Health | various | Catalog number may vary based on lot number |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | User preference |
| Serological pipet controller | Gilson | F110120 | User preference |
| Storage bottle 100–500 mL | VWR | 76311-770 | User preference |
| Urea Nitrogen (BUN) Test | Stanbio | 0580-250 | |
| Water bath | PolyScience | WBE05 | Capable for use at 37 °C |
Referenzen
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