用于药物开发应用的全人肝培养系统

该协议遵循 Lifenet Health 伦理委员会的指导方针。该手稿不包含任何作者对人类参与者进行的任何研究或动物研究。所有细胞均从供体组织中分离出来，并完全同意Lifenet Health用于研究目的。 1.培养基制备 在37°C水浴中或在4°C下解冻16-24小时，每个饲养细胞解冻培养基，补充A，补充B和补充C（见 材料表）各一瓶。 将整瓶 （10 mL） 饲养细胞解冻培养基等分装到 15 mL 或 50 mL 锥形管中。注意：使用 15 mL 锥形管更容易查看细胞沉淀的大小。 将 4.5 mL 补充剂 B 和 11 mL 补充剂 A 加入一瓶电镀介质 （75 mL）（参见 材料表）中，制成完整的电镀介质。注意：完全电镀介质的FBS浓度为<5% v/v。 在单独的瓶子中加入 100 mL 培养基（参见 材料表）、1 mL 添加剂 C 和 14 mL 添加剂 A，制成完整的培养基。注：完全培养基的FBS浓度为<1% v / v 将剩余的补充剂C和补充剂A储存在-20°C下，直到第2周培养基制备。注意：反复的冻融循环会缩短补充剂的保质期。建议只冻融一次。 使用前，将10mL饲养层细胞解冻培养基，肝细胞解冻培养基，完全铺板培养基和完全培养基在37°C水浴中加热20-30分钟。 2. 解冻、计数和铺板人饲养层细胞（图 1A） 在接种PHH之前培养饲养层细胞约1小时，在37°C水浴中解冻饲养层细胞（参见 材料表）1-2分钟。注意：当液体倒置时在冷冻管中变得松散时，通过监测解冻和取出小瓶来避免长时间暴露（例如，>2 分钟）。 解冻后，立即将饲养细胞放在冰上。 使用无菌技术，在生物安全柜 （BSC） 中，将新解冻的细胞加入 10 mL 饲养层细胞解冻培养基中。 使用 1000 μL 移液管用 1 mL 细胞/解冻培养基悬浮液洗涤小瓶一次并收集。 在室温（RT）下以400× g 旋转4分钟。 小心地丢弃上清液，以免通过移液或真空抽吸干扰细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于 1 mL 完全接种培养基中并计数饲养层细胞。注意：可以在自动细胞计数器上使用吖啶橙和碘化丙啶 （AOPI） 或使用血细胞计数器对台盼蓝进行饲养层细胞计数。细胞计数可能因技术和用户而异。为获得最佳结果，请对重复样品进行计数，并在所选方法中保持一致。 使用完全接种培养基将细胞悬液稀释至 100,000 个细胞/mL。 将稀释的细胞悬浮液每孔500μL（50,000个细胞）铺在胶原包被的24孔板上（参见 材料表）。 在 N-S 方向上来回运动 2 次，然后以相同的运动 E-W 以北 （N）-南 （S）-东 （E）-西 （W） 运动摇晃板。重复此摇晃方案 2 次，总共 3 轮。注意： 使用适度的力进行摇晃，以避免溅到板盖上，同时仍有助于细胞分布（请参阅视频）。 在37°C / 5%CO2 下孵育60分钟。 在继续解冻肝细胞之前查看饲养细胞附着。注意：可接受的饲养细胞附着在视觉上约为 50% 汇合。 3. 解冻、计数和铺板原代人肝细胞（图 1B） 在饲养层细胞培养30分钟后，通过0.2μm聚醚砜（PES）过滤单元过滤预热的肝细胞解冻培养基。 在37°C水浴中解冻PHHs1-2分钟。注意：当液体倒置时在冷冻管中变得松散时，通过监测解冻和取出小瓶来避免长时间暴露（例如，>2 分钟）。 解冻后，立即将PHH放在冰上。 在 BSC 中，将 PHH 悬浮液倒入肝细胞解冻培养基中。注意：尽可能避免移液PHH细胞悬浮液。在将解冻的PHH从冷冻管转移到解冻介质的过程中，最关键的是不要进行移液。 使用 1000 μL 移液管洗涤小瓶 3-4 次，将 1 mL 肝细胞/解冻培养基悬浮液轻轻移液回小瓶中，然后将其倒回解冻培养基中收集洗涤液。 盖上盖子并轻轻倒置解冻的PHH悬浮液5次。 在室温下以100× g 旋转8分钟。 小心地丢弃上清液，以免通过移液或真空抽吸干扰细胞沉淀。在锥形管壁上，加入 3 mL 完全电镀介质。 左右摇晃锥形管以重悬细胞沉淀。 向重悬的肝细胞中再加入 5 mL 完全铺板培养基。 计算 PHH。注意：PHH可以在自动细胞计数仪上使用AOPI进行计数，也可以使用血细胞计数器使用台盼蓝进行计数。细胞计数可能因技术和用户而异。为获得最佳结果，请对重复样品进行计数，并在所选方法中保持一致。 使用完全接种培养基将细胞悬液稀释至所需的接种密度（300,000-600,000 PHHs/mL）。注意：最佳肝细胞接种密度可能因批次而异。给定批次的推荐播种密度将在分析证书 （COA） 中提供。使用以下公式确定 24 孔板的肝细胞/mL。 从镀层的补层细胞中，通过移液或真空抽吸除去培养基。注意：为确保饲养层细胞的活力，建议一次更换不超过 3 个孔。 立即将稀释的肝细胞悬浮液每孔 500 μL（150,000-300,000 个细胞）铺板到含有饲养细胞的预包被胶原 24 孔板上。 在 NS 方向上来回运动 2 次，然后以相同的运动 E-W 以 N-S-E-W 运动摇晃板。重复此摇晃方案 2 次，总共 3 轮。注意： 使用适度的力进行摇晃，以避免溅到板盖上，同时仍有助于细胞分布。 在37°C/5%CO2 下孵育2-4小时。对于培养的前 60 分钟，如上面的步骤 3.15 所示，以 N-S-E-W 运动每 15 分钟摇动一次板。 孵育后，将板从培养箱中取出并将其放入 BSC 中。 摇晃板，通过移液或真空吸液除去完整的镀层介质。注意：为确保培养物的活力，建议一次更换不超过 3 个孔。 立即向每个孔中加入 500 μL 预热的完全培养基。 4. 维护 将等分试样和预热的完全培养基在37°C水浴中浸泡20-30分钟。 一个24孔板需要约13.5mL培养基。 每天用每孔 500 μL 的新鲜预热完全培养基喂养培养物。注意：为确保培养物的活力，建议一次更换不超过 3 个孔。 每 7 天制备一次新鲜的完整培养基。 5. 收集用于测量白蛋白和尿素的培养上清液样品 在第 7、10 和 14 天，将 500 μL 培养基从所需样品孔中收集到微量离心管中，如 图 1C 所示。 将样品在4°C下以320× g 旋转10分钟以沉淀碎片。 使用移液管将样品上清液转移到新的微量离心管中，避免沉淀中断。 在白蛋白和/或尿素测定中运行样品（分别参见第 10 节和第 11 节）。注意：样品可以在-20°C至-80°C下储存2周。 6. 染色第一天 注意：固定缓冲液含有多聚甲醛。多聚甲醛会引起眼睛损伤、皮肤刺激和器官毒性。在通风良好的区域工作，并穿戴适当的个人防护装备 （PPE）。 在第 14 天收集培养基样品后，向每个要染色的孔中加入 300 μL 固定缓冲液（参见 材料表），如 图 1C 所示。至少染色 2 个孔。 在4°C孵育20-60分钟。 通过向 45 mL 1x PBS 中加入 5 mL 10x 储备溶液（参见材料表）来制备 1x 透化缓冲液（参见材料表）。注意：1x 透化缓冲液可在 4°C 下储存 1 个月。 用 300 μL 1x 透化缓冲液在冰上洗涤 2 次。 加入 300 μL 一抗细胞角蛋白 18（参见 材料表），在冰上的 1x 透化缓冲液中以 1：1000 的稀释度。注意：至少，仅将 1x 通透缓冲液孵育一个孔，用于仅二抗对照。 在4°C孵育16-24小时。 7. 染色第二天 第二天，通过移液或真空抽吸去除一抗。 在冰上用每孔 300 μL 的 1x 透化缓冲液洗涤 2 次。 加入 300 μL 荧光二抗（参见 材料表），在 1x 通透缓冲液中以 1：500 的稀释度（包括仅二次对照）。注意：使用荧光抗体时避免光线。 在4°C下在黑暗中孵育30-45分钟。 通过移液或真空抽吸去除二抗。 在冰上用每孔 300 μL 的 1x 透化缓冲液洗涤 2 次。 用 300 μL 每孔 1x PBS 洗涤 1 次。 向每个孔中加入150μL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封固剂（参见 材料表），并在室温下在黑暗中孵育15分钟。注意：板可以包裹在封口膜中，并在4°C下在黑暗中储存1周。 在荧光显微镜下观察。使用 10 倍物镜为每个孔捕获每个特定荧光通道的 5 张图像（确保一张图像具有比例尺）。注意：DAPI 的激发/发射波长为 358 nm/461 nm。使用配备DAPI和荧光团二抗检测滤光片的荧光显微镜。 8. ImageJ分析（图2） 注意：建议使用 ImageJ 版本 1.52a 或更高版本。 在 ImageJ 中打开包含比例尺的图像。单击 “直线 ”图标，然后绘制一条线到比例尺的确切长度 [图 2 （1）]注意： 如果需要，请单击 放大镜 图标以放大或缩小。 单击 “分析 ”选项卡。突出显示并单击 设置比例。 将 “已知距离” 更改为比例尺的距离。 将“长度单位” 更改为比例尺的单位。通过选中 全局应用设置。单击 “确定 ”设置比例。注意：应用此设置后，打开的每张图像都将以用户输入的单位显示视野的计算面积。 在 ImageJ 中打开仅限 DAPI 的图像。单击 “处理 ”选项卡并突出显示“ 减去背景”。一次删除背景 50 像素，直到未染色的区域变黑。注意：如果图像不包含背景，则不需要此步骤。 单击 “图像 ”选项卡并突出显示 “类型”。单击 8 位 使图像灰度 [图 2 （2）]。 手动或自动对图像进行阈值以包含所有DAPI粒子（注意不要手动超过阈值）[图2 （3）]。单击 “图像 ”选项卡并突出显示 “调整”。单击 “阈值”。完成后单击 应用 。 单击“ 进程 ”选项卡并突出显示 “二进制”。单击 分水岭。 单击 “分析 ”选项卡并加亮显示/单击 “分析粒子 ”[图 2 （4）]。将 大小 设置为 5-无穷大 ，将 圆度 设置为 0.00-1.00。在 显示 下拉选项卡中，选择 大纲。确保选中 “显示结果”、“ 汇总”和 “包括孔 ”。单击 “确定”。注意：如果阈值产生背景像素，则可以调整所需的粒子范围。 将计数结果记录为 TOTAL DAPI。 在 ImageJ 中打开合并的细胞角蛋白 18/DAPI 图像。 使用 多点 [图 2 （5）] 图标手动计数所有未染色的细胞角蛋白 18 DAPI 颗粒。 将结果记录为 FEEDER CELLS。使用下面的公式确定肝细胞 DAPI。肝细胞 DAPI = 总 DAPI – 饲养层细胞 DAPI 9. 总附着肝细胞和附着百分比的定量（可电镀性） 使用以下公式为 24 孔培养区域创建比例因子。视场测量值可以在打开的每张图像的顶部找到[图2 （2），绿色框]。 使用下面的公式计算附着的肝细胞总数。附着的肝细胞 = 肝细胞 DAPI ×比例因子 使用下面的公式计算肝细胞附着的百分比。 10. 白蛋白测定 使用夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）（参见 材料表）在以1：200稀释的样品上测量白蛋白的产生。注意：为了准确起见，用户确认样品落在标准曲线线性范围内。指定的试剂盒提供执行测定的所有材料和说明。 使用下面的公式将样品浓度归一化到附着的肝细胞。 11. 尿素测定 注意：血尿素氮 （BUN） 酸试剂含有硫酸。BUN酸试剂中的硫酸浓度被认为是腐蚀性的。不要摄入。在通风良好的区域工作，并穿戴适当的个人防护装备。 使用改良的二乙酰一肟法测量尿素合成（见 材料表）。 将 53.3 μL 75 mg/dL 尿素稀释到 346.7 μL 完全培养基中，制成标准品 #1 （100 μg/mL） 标记管2-8并使用1：2连续稀释制成尿素测定标准品（表1）。 将 10 μL 样品或标准品加入黑壁透明底部 96 孔板的孔中（参见 材料表）。 向每个含有样品的孔中加入 150 μL BUN 试剂。将 1/3 的 BUN 颜色试剂与 2/3 BUN 酸试剂混合制备 BUN 试剂。使用下面的公式来辅助计算。BUN 颜色试剂 （mL） = 所需的总 BUN 试剂 × 0.333BUN 酸试剂 （mL） = 所需的总 BUN 试剂× 0.667 将板在60°C的烤箱或培养箱中孵育90分钟。 立即读取 540 nm 和 650 nm 处的板吸光度。 通过从所有样品和标准品中减去空白和背景吸光度（650nm）来创建标准曲线。通过线性回归分析生成最佳拟合线。 从标准曲线确定未知样品浓度。 使用下面的公式将样品浓度归一化为附着的肝细胞。