여기에서는 하중을 견디는 힘줄 코어 조직과 질병 및 부상에 의해 활성화된 세포 집단을 포함하는 외인성 구획 사이의 힘줄 세포 누화를 모방하는 조립체 모델 시스템을 제시합니다. 중요한 사용 사례로, 외인성 내피 세포의 질병 관련 활성화를 조사하기 위해 시스템을 배포하는 방법을 보여줍니다.
힘줄은 근육의 힘을 뼈에 전달하여 운동을 가능하게 합니다. 그들은 콜라겐 섬유와 기질 세포 집단으로 구성된 단단한 힘줄 코어에 의존합니다. 이 하중을 견디는 코어는 외인성 힘줄 구획을 구성하는 활액과 같은 조직층에 의해 둘러싸이고, 영양이 공급되고, 복구됩니다. 이러한 정교한 설계에도 불구하고 힘줄 부상은 흔하며 임상 치료는 여전히 물리 치료와 수술에 의존합니다. 사용 가능한 실험 모델 시스템의 한계로 인해 새로운 질병 변형 치료법 및 재발 방지 임상 요법의 개발이 느려졌습니다.
생체 내 인간 연구는 건강한 힘줄과 복원 수술 중에 샘플링한 말기 질병 또는 파열 조직을 비교하는 것으로 제한되며 근본적인 힘줄 질환에 대한 종단 연구는 허용하지 않습니다. 생체 내 동물 모델은 또한 불투명한 생리학적 복잡성, 동물에 대한 윤리적 부담 및 사용과 관련된 큰 경제적 비용과 관련하여 중요한 한계를 제시합니다. 또한, 생체 내 동물 모델은 약물 및 다세포, 다중 조직 상호 작용 경로의 체계적인 탐색에 적합하지 않습니다. 더 간단한 in vitro 모델 시스템도 부족했습니다. 한 가지 주요 이유는 힘줄 세포와 그 기능을 의미 있게 연구하는 데 필요한 3차원 기계적 하중을 적절하게 복제하지 못했기 때문입니다.
여기에 제시된 새로운 3D 모델 시스템은 쥐 꼬리 힘줄 코어 외식을 활용하여 이러한 문제 중 일부를 완화합니다. 중요한 것은 이러한 외식은 단일 마우스에서 대량으로 쉽게 접근할 수 있고, 세포 수준에서 3D in situ 로딩 패턴을 유지하며, in vivo 유사 세포외 기질을 특징으로 한다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 외인성 힘줄 구획 내에서 질병 및 부상 활성화 세포 집단을 대체하기 위해 근육 유래 내피 세포, 힘줄 유래 섬유아세포 및 골수 유래 대식세포가 함유된 콜라겐 하이드로겔로 힘줄 코어 외식을 보강하는 방법에 대한 단계별 지침이 제공됩니다. 그 결과 힘줄 아셈블로이드가 기계적으로 또는 정의된 미세환경 자극을 통해 도전하여 질병 및 부상 중에 발생하는 다세포 누화를 조사할 수 있는 방법을 보여줍니다.
근육의 힘을 뼈에 전달하여 움직일 수 있도록 하는 기능에서 힘줄은 인체에서 발생하는 가장 극심한 기계적 스트레스에 직면합니다 1,2,3. 고령화 사회, 비만 유병률 증가, 기계적으로 힘든 스포츠 활동의 인기 증가로 인해 선진국에서 힘줄 질환 및 부상의 유병률이 증가할 것으로 예상됩니다 4,5,6. 이러한 증가에 대처하기 위한 새로운 증거 기반 및 질병 수정 치료 요법의 개발은 현재 이용 가능한 모델 시스템의 한계로 인해 방해를 받고 있다 1,7,8.
이상적으로, 질병 및 부상 복구 모델은 표적 기관이 교란 요인을 통제하면서 정의된 입력 매개변수 세트(질병 유발 요인 모방, 표 1)를 측정 가능한 출력 매개변수(질병 특징 표시, 표 2)로 처리하는 방법을 연구할 수 있습니다. 이러한 모델 시스템을 사용하는 연구는 질병 및 부상 복구의 기저에 있는 (병리적) 생리학적 과정을 식별하고 클리닉에서 질병 및 부상 특징을 예방하거나 줄이는 데 활용할 수 있는 지식을 얻을 수 있습니다. 이 원리를 힘줄에 적용하면, 유용한 모델 시스템은 질병 및 부상에 대한 생체 내 힘줄 반응의 중심 부분을 요약해야 하며, 이는 다음과 같은 특징을 포함해야 합니다: 미세 손상, 염증, 신생혈관화, 과세포성, 가속화된 매트릭스 회전율 및 구획 제거(decompartmentalization) 9,10,11,12,13,14,15 . 이러한 특징을 기반으로 성공적인 힘줄 질환 및 부상 복구 모델 시스템을 위한 다음과 같은 요구 사항을 추론할 수 있습니다.
기계적 과부하는 힘줄 손상 및 질병 발병의 핵심 요인으로 가정되며, 따라서 미세 손상을 일으키기 위해 일반적으로 사용되는 실험적 접근 방식입니다16. 따라서 제어 가능한 기계적 하중 가능성은 힘줄 질환 및 부상 수리 모델의 주요 전제 조건입니다. 이상적으로 모델 시스템은 단일 신축-손상 하중, 피로 하중 및 언로딩 8,17,18의 세 가지 주요 모드를 사용할 수 있습니다. 기계적 변형 시, 조직-상주 세포는 인장력, 전단력(세포를 둘러싼 콜라겐 섬유의 슬라이딩으로 인해) 및 언로딩 중 또는 엔테시스 근처에서 발생하는 압축력의 복잡한 조합을 경험한다(19,20). 모델 시스템은 이러한 복잡한 하중 패턴을 가능한 한 가깝게 재현해야 합니다.
매트릭스 미세 손상을 도입하는 또 다른 방법은 (전)염증성 사이토카인, 산화 스트레스 또는 높은 포도당 농도와 같은 힘줄 질환 및 부상에 대한 전신 소인을 모방하는 생화학적 스트레스 요인을 활용하는 것입니다 21,22,23. 결과적으로, 제어 가능한 틈새 미세환경은 힘줄 질환 및 부상 복구 모델 시스템에 유리합니다.
모델 시스템이 염증, 신생혈관 형성 및 과세포성을 재현할 수 있는 일반적인 전제 조건은 이러한 과정을 주도하는 세포 집단의 선택적 존재이다24. 염증 과정의 경우 이러한 집단에는 호중구, T 세포 및 대식세포가 포함되며 신생혈관을 연구하려면 내피 세포와 주위 세포가 필요합니다 25,26,27,28,29. 힘줄 섬유아세포는 힘줄 복구에 필수적일 뿐만 아니라 증식 및 이동 세포로서 힘줄 질환에서 관찰되는 국소 과세포성(local hypercellularity)의 부분적인 원인이기도 하다 30,31,32,33,34,35,36.
상주 세포 집단의 변화 외에도 힘줄 기질 구성은 힘줄 질환 및 부상에서도 변경됩니다 7,37,38,39,40. 올바른 질병 관련 미세환경 단서를 제시하기 위해 모델 시스템은 예를 들어 콜라겐-1, 콜라겐-3 및 세포 피브로넥틴41의 관련 비례 조합을 가능하게 하여 표적 질병 또는 손상 단계와 일치하는 세포외 기질 조성을 통합할 수 있어야 합니다.
건강한 힘줄이 힘줄 코어와 외적 구획(즉, 엔도테논, 에피테논 및 파라테논)으로 구획화되는 것은 그 기능의 중심이며 병들거나 손상된 힘줄에서 종종 방해를 받습니다 1,42,43,44,45,46,47 . 따라서 3D 힘줄 구획화를 힘줄 모델 시스템에 통합하는 것은 탈구획화 및 재구획화의 기초가 되는 과정을 보다 면밀하게 시뮬레이션하는 데 필요할 뿐만 아니라 사이토카인 및 영양소48,49의 정확한 시공간 구배를 설정하는 데 도움이 됩니다.
마지막으로, 모듈화는 모델 시스템의 또 다른 핵심 자산으로, 연구자들은 조사 프로세스 8,17 동안 앞서 설명한 스트레스 요인의 정확한 상대적 기여와 상호 작용을 결합할 수 있습니다.
최적의 입력 방식을 선택하는 것 외에도 중요한 단계는 결과 출력의 변화를 측정, 관찰 및 추적할 수 있는 능력입니다. 모델 시스템의 기계적 특성(즉, 발가락 영역 길이, 선형 탄성 계수, 최대 인장 변형률, 최대 인장 응력, 피로 강도 및 응력 완화)은 힘줄의 주요 기능(50,51,52)을 특징짓기 때문에 여기에서 핵심입니다. 이러한 기능적 변화를 조직 수준의 변화와 연결시키려면 (콜라겐) 구조적 매트릭스 손상을 검출하고 질병 및 복구 관련 세포 집단 30,53,54,55,56,57,58,59,60의 증식 및 모집을 추적하는 방법을 활성화하는 것이 중요합니다.
새로운 세포-세포 및 세포-기질 누화를 연구하려면 정량화를 위해 적절한 양의 단백질을 분리하거나 표시할 수 있어야 합니다(예: ELISA, 단백질체학, 면역조직화학, 유세포 분석)14,21,61,62. 집단 또는 적어도 구획 특이적 유전자 발현 분석도 가능해야 합니다(즉, 형광 활성화 세포 분류[FACS], 단일 세포/벌크 RNA- 염기서열 분석 및 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR))21,24,27,63. 모델 시스템은 동일한 시편과 여러 시편에서 앞서 언급한 출력 파라미터를 고처리량 연구를 수행할 수 있을 만큼 충분히 빠른 방식으로 측정할 수 있어야 합니다.
현재 인간의 힘줄 질환 및 부상 회복을 연구하는 데 사용할 수 있는 모델 시스템 중 인체 자체가 가장 대표적인 시스템입니다. 또한 실험적 개입과 가장 호환되지 않습니다. 급성 힘줄 손상 환자는 임상 연구가 풍부하지만, 초기 건병증(가장 흔한 힘줄 질환)이 있는 환자는 대체로 증상이 없으며 더 심각한 변화가 나타날 때까지 임상적으로 발견되지 않는 경우가 많습니다 14,64,65. 이것은 힘줄 항상성이 탈선하는 결정적인 순간과 이 탈선의 배후에 있는 메커니즘을 정확히 지적하기 어렵게 만든다 16,66,67,68,69. 또한 건강한 힘줄에서 생검을 추출하는 것은 지속적인 손상을 초래할 수 있기 때문에 윤리적으로 어려운 일입니다. 전방십자인대 재건술로 인한 햄스트링 힘줄 잔여물은 건강한 대조군으로 자주 사용되지만, 힘줄 질환 및 부상에 의해 일반적으로 영향을 받는 회전근개, 아킬레스건, 슬개건에 비해 기능, 기계적 특성, 세포 집단 및 기질 구성이 다르다70,71,72,73.
생체 내 동물 모델은 더 접근하기 쉽고 다루기 쉽지만 그 사용은 동물에게 상당한 윤리적 부담을 지우고 연구자에게 경제적 비용을 부과합니다. 또한, 대부분의 인기 있는 모델 동물은 자연적으로 건병증성 병변이 발생하지 않거나(즉, 쥐, 생쥐, 토끼) 관련된 다세포 통신 경로를 추적하는 데 필요한 프라이머 및 유전자 변형 균주가 부족합니다(즉, 말, 토끼).
간단한 2D in vitro 모델 시스템은 복잡성/다루기 쉬운 스펙트럼의 반대편에 있으며 보다 제어 가능한 트리거 세트에 대한 반응으로 특정 세포 간 통신 경로에 대한 제어되고 시간 효율적인 연구를 더 잘 가능하게 합니다 8,74. 그러나 이러한 단순화된 시스템은 일반적으로 힘줄 기능의 핵심인 다차원 기계적 하중(즉, 인장, 압축 및 전단)을 재현하지 못합니다. 또한, 조직 배양 플라스틱의 (너무) 높은 강성은 질병 관심 상태를 모방하기 위한 코팅에 의해 제공되는 모든 매트릭스 큐를 무시하는 경향이 있다75,76.
이러한 단점을 극복하기 위해, 점점 더 정교해지는 조직-공학적 3D 모델 시스템들이 개발되어, 그 조성이 적어도 부분적으로 원하는 질병 상태(77,78,79)와 일치할 수 있는 로딩 가능한 매트릭스를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 시스템들은 복잡한 생체 내 세포외 기질 조성물 및 세포 로딩 패턴을 정확하게 복제하는 데 어려움을 겪을 뿐만 아니라, 일반적으로 힘줄 질환 및 부상 복구를 조정하는 교차 구획 통신 경로를 연구하는 데 필요한 장기간의 로딩성 및 구획 인터페이스가 부족합니다 48,49,80.
체외 힘줄 이식 모델 시스템은 세포 주위 틈새, 교차 구획 장벽 및 시공간 사이토카인/영양 구배로 구성되고 늘어났을 때 복잡한 로딩 패턴을 재현하는 내장 생체 유사 매트릭스 구성의 뚜렷한 이점을 가지고 있습니다8. 크기에 따른 영양소 확산 제한의 결과로, 더 큰 동물 모델(즉, 말)로부터의 이식은 힘줄 질환 및 부상 복구에 대한 장기 연구를 위해 살아 있는 상태로 유지하기가 어렵다 81,82,83. 한편, 쥐 종의 작은 외식물(예: 아킬레스건, 슬개건)은 재현성 있게 클램핑하고 기계적으로 하중을 가하기가 어렵습니다. 또한 크기가 크기 때문에 세포, 단백질 및 유전자 수준 판독을 위해 수집할 수 있는 물질의 양이 제한되며, 샘플을 풀링하거나 처리량을 줄이지 않습니다. 이러한 의미에서 쥐꼬리 힘줄 근막은 단일 마우스에서 대량으로 쉽게 구할 수 있기 때문에 힘줄 질환 및 부상 복구에 대한 고처리량 연구를 가능하게 하고, 복잡한 생체 내 세포 주위 기질 구성을 보존하고, 세포 로딩 패턴을 재현할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나 추출 과정에서 그들은 외적 구획의 대부분을 잃고 그 안에는 현재 힘줄 질환을 유발하고 8,18을 복구하는 것으로 간주되는 혈관, 면역 및 섬유 아세포 집단이 포함되어 있습니다.
이러한 간극을 메우기 위해 쥐꼬리 힘줄 유래 코어 외식의 장점과 3D 하이드로겔 기반 모델 시스템의 장점을 결합한 모델 시스템이 개발되었습니다. 이 모델 시스템은 꼬리 힘줄 외엽 주위의 세포가 함유된(콜라겐-1) 하이드로겔(84,85)로 구성됩니다. 이 논문에서는 내피 세포가 함유된 1형 콜라겐 하이드로겔(외인성 구획) 내에서 핵심 외식(내장 구획)을 공동 배양하여 얻을 수 있는 유용한 판독값과 함께 필요한 제조 단계를 자세히 제공합니다.
전반적으로 여기에 제시된 조립체 모델 시스템에는 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 모델 시스템은 구성 요소의 품질만큼만 우수합니다. 조립 공정을 시작하기 전에 현미경으로 코어 explant와 seed-to-seeded cell population을 확인하는 것이 중요합니다. 유세포 분석으로 분리된 세포 집단의 표현형을 한 번 이상 확인하는 것도 마찬가지로 중요합니다. 특히 콜라겐-1의 새로운 배치를 처음 사용하는 경우 세포를 삽입하기 전에 시험 실행에서 가교 속도를 확인하는 것이 유리합니다. 조립체 어셈블리는 많은 수동 취급이 필요하므로 감염 위험이 높아집니다. 감염 위험을 최소화하려면 층류 공기 흐름이 있는 멸균 생물 안전 후드에서 작업하고, 장갑을 자주 교체하고, 장갑과 작업 공간을 80% 에탄올로 오염 제거하십시오. 비슷한 이유로 3D 프린팅 클램프 홀더를 두 번 이상 사용하지 마십시오. 임베딩 공정 자체에 앞서 모든 하이드로겔 성분(가교 용액, 콜라겐-1 용액)을 얼음 위에 보관하여 조기 가교를 방지하는 것이 중요합니다. 결과적으로, 가교 용액의 높은 pH와 낮은 온도로 인한 세포 사멸을 제한하기 위해 세포가 가교 용액에 첨가되면 신속하게 작업해야 합니다. 코어 외식에서 건조 관련 세포 사멸을 방지하려면 가교 용액을 콜라겐-1 용액과 혼합하기 직전에 클램핑된 코어 외식을 덮고 있는 배지를 흡인합니다. 하이드로겔 내에서 코어 외식의 중앙 배치를 보장하려면 약간 장력이 가해진 클램핑된 코어 외식구 주위에 하이드로겔을 주조하는 것이 이상적입니다. 이렇게 하려면 맞춤 핀과 M3 x 16mm 볼트 나사를 사용하여 클램프 홀더를 적절한 길이의 구멍이 있는 (3D 프린팅) 플레이트 세트에 고정합니다. 50분의 중합 시간 후, 내장된 코어 explant는 원하는 배양 조건에 따라 다시 디텐션될 수 있습니다. 배양 중 집합체가 경험하는 긴장의 양은 실험 결과에 지대한 영향을 미치며 샘플과 조건 전반에 걸쳐 균일하게 유지되어야 한다21.
그럼에도 불구하고, 실험 결과에 대한 기계적 (비)로딩의 큰 영향은 대부분의 조직 공학적 대안에 비해 조립체 모델의 주요 이점이며, 특히 코어 이식물의 유지된 매트릭스 조성이 세포 수준(90)에서 복잡한 생체 내 로딩 패턴을 재현해야 하기 때문입니다. 실제로, 지금까지 선형탄성률, 최대 인장 변형률 및 어셈블로이드의 최대 인장 응력의 측정만이 입증되었지만, 피로 강도 및 응력 완화 측정에 대한 프로토콜은 다른 곳에서 힘줄 코어 외식에 대해 설명되었으며 어셈블로이드(91,92)에 적용할 수 있어야 한다. in vivo와 같은 로딩 패턴 외에도 어셈블리의 다단계 모듈화가 가장 큰 장점일 것입니다. 개별 배양 챔버 덕분에 각 샘플에 대해 제어 가능한 틈새 조건 세트(예: 온도, 산소 장력, 포도당 농도, 보충제, 자극제, 억제제 및 플레이트를 사용한 정적 스트레치)를 개별적으로 설정할 수 있습니다. 다음으로, 외인성 구획의 매트릭스 강성 및 매트릭스 조성은 하이드로겔 조성물을 통해 맞춤화할 수 있으며, 예를 들어, 더 많은 콜라겐-3 및 세포 피브로넥틴 93,94,95를 통합함으로써 점점 더 병든 조직 미세환경의 영향을 연구할 수 있습니다. 외인성 구획에서 평가된 세포 집단은 파종할 세포를 선택하여 쉽게 적응할 수 있지만 확립된 유전자 변형 세포주 및 마우스 세포주(즉, ScxLin 세포 고갈)를 활용하여 힘줄 코어 이식에서 변형될 수도 있습니다(즉, ScxLin 세포 고갈)96. 두 구획의 상이한 매트릭스 및 세포 조성은 또 다른 중앙 힘줄의 특징인 고유한 구획화된 3D 구조를 추가로 제공합니다(1,30,46).
이 시스템을 사용할 때 결과 매개변수의 세분성에 대한 시스템의 모듈성의 결과를 고려하는 것이 중요합니다. 세포 증식 및 모집은 각 구획에 대해 개별적으로 평가할 수 있지만 기계적 특성, 세크레톰(secretome) 성분 및 분해 산물은 현재 전체 집합체에 대해서만 측정할 수 있습니다. 처리량과 관련하여, 적절한 교육을 받은 한 사람이 정규 근무일에 최대 50개의 어셈블로이드를 준비할 수 있으며, 주요 병목 현상은 클램핑 절차입니다. 일부 판독 방법은 상호 배타적이지만, 종점에서 세포 집단 구성(유세포 분석), 세포 전사체(RT-qPCR, RNA 염기서열 분석) 또는 매트릭스 및 세포 분포(면역세포화학/형광 현미경)뿐만 아니라 동일한 샘플에서 기계적 특성 및 분비체 성분을 반복적으로 평가할 수 있습니다. 이전 간행물에서, 이러한 방법들은 병변과 같은 틈새에 노출된 코어 // 섬유아세포 및 코어 // 대식세포 집합체에서 세포간, 교차 구획 상호작용을 광범위하게 특성화하기 위해 배치되었다84,85. 이 연구에서는 서로 다른 미세환경 자극 하에서 코어 세포와 외인성 내피 세포 간의 교차 구획 상호 작용을 조사하는 조립체 모델 시스템의 기능을 탐구했습니다.
모델 시스템의 모듈화는 현재 설계 반복의 다음과 같은 한계를 극복하는 데 필요한 방법의 향후 개선을 허용합니다. 이 연구에서 제시된 유세포 분석과 최근 발표된 단일 세포 RNA 염기서열 분석 데이터는 힘줄 코어 상주 건세포와 아킬레스건 유래 집단이 이전에 가정했던 것보다 더 이질적이라는 것을 보여주었습니다 24,34,59,84,97. 또한, 초기 코어 또는 하이드로겔 상주 세포 집단의 이동 행동은 배양 중에 집합체 구획화를 흐리게 합니다. 두 가지 요인 모두 전사체의 차이를 특정 세포 유형에 기인하고 증식과 이동 기반 과정을 분리하는 것을 어렵게 만듭니다. 이러한 한계는 최근 in vivo 연구에서 특성화된 건강한 힘줄이나 병든 힘줄의 세포 조성을 기반으로 하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 입력 모집단을 정제하고, 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 구현하여 판독을 개선하고, 현미경 검사 중 EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine) 염색과 같은 증식 마커를 통합함으로써 극복할 수 있습니다.
여기에 제시된 아셈블로이드는 또한 신체의 나머지 부분과 분리된 병든 장기를 시뮬레이션하는 현재 사용 가능한 대부분의 시험관 내 시스템과 약점을 공유합니다98,99. 그러나 여기에 사용된 배양 챔버 기반 플랫폼은 서로 다른 장기를 모방한 집합체가 연결되고 장기 간 상호 작용을 연구할 수 있는 다중 장기 플랫폼에 통합하기 위해 모델 시스템을 잘 포지셔닝합니다.
기본적으로 모델 시스템은 위치 설치류 힘줄을 기반으로 하며, 이로 인해 고유한 단점이 있습니다. 첫째, 결과의 번역 가능성은 힘줄 질환을 앓지 않거나 고통받는 야생형 마우스에 의해 방해를 받는다 8,100,101. 힘줄 질환의 양상을 보이는 인간 또는 새로 개발된 쥐 균주의 조직과 세포를 통합하면 이 문제를 완화할 수 있다102. 인간 기반 집합체로의 전환은 다양한 질병을 앓고 있는 힘줄(예: 건염, 건증 또는 주위건염)에서 환자 유래 조직과 치료 저항성 기증자를 대상으로 보다 개인화된 치료 프로그램을 제공할 수 있는 연구를 가능하게 하기 때문에 특히 흥미롭습니다. 둘째, 쥐꼬리 힘줄 외피는 과부하로 인한 미세 손상을 특히 잘 처리하지 못하기 때문에 급성 힘줄 손상 연구를 위한 모델 시스템의 적용 가능성이 제한적입니다.
이러한 모든 이유로, explant // 하이드로겔 아셈블로이드는 틈새 유도 미세 손상에 대한 반응으로 힘줄 코어 생물학, 매트릭스 구조-기능 상호 작용 및 특정 세포 집단 간의 교차 구획 상호 작용을 연구할 수 있는 최고의 위치에 있습니다. 이러한 다소 높은 처리량의 연구에서 수집된 통찰력은 생체 내 연구 및 치료법 개발에 대한 방향을 제시할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 ETH 보조금 1-005733의 자금 지원을 받았습니다
0.4 mm x 25 mm injection needle (G27) | Sterican | 9186174 | |
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament | Prusa | NA | |
4% formaldehyde | Roti-Histofix | P087.4 | |
Accutase cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Amphotericin | VWR | L0009-100 | |
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2 | Motic | NA | |
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel | RS PRO | 1871235 | |
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel | RS PRO | 1871207 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CD146 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 134703 | |
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 141709 | |
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 102413 | |
CD86 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 105007 | |
Collagenase I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392-100ML | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 7000183 | |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
DMEM/F12 | Sigma | 7002211 | |
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel | Accu | HDP-3-16-A1 | |
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone | KauPO | 09301-004-000001 | |
Endopan 3 Kit | Pan-Biotech | P04-0010K | |
Endothelial cell growth supplement | Lonza | CC-3162 | |
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 30121023 | |
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO | Sigma-Aldrich | 46043-1MG-F | |
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse | BioLegend | 123151 | |
Falcon plastic tube (15 mL) | Corning | 352096 | |
Falcon plastic tube (50 mL) | Corning | 352070 | |
Flow cytometer: LSR II Fortessa | BD Bioscience | 23-11617-02 | |
Gelatin | Invitrogen | D12054 | |
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate | Sigma | Z805939-1EA | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
Hydroxyproline assay | Sigma-Aldrich | MAK008 | |
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML | Motic | NA | |
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate | Wako Chemicals | 013-19641 | |
LSE Low Speed Orbital Shaker | Corning | 6780-FP | |
MEM non-essential amino acids | Sigma | 7002231 | |
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF) | PeproTech | 315-02-50ug | |
MSD assay | Mesoscale Discovery | various | |
NucBlue | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nylon mesh strainer cap, 100 µm | Corning | 734-2761 | |
Original Prusa i3 MK3S 3D printer | Prusa | i3 MK3S | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L | Gibco | 10010001 | |
Puromycin | Gibco | A1113803 | |
RBC lysis buffer | VWR | 786-650 | |
recombinant m-CSF | PeproTech | 315-02 | |
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro | Qiagen | 74034 | |
Slicing software: PrusaSlicer | Prusa | NA | Version 2.6.0 or higher |
Sterile Cell Strainer 100 µm | Fisherbrand | 22363549 | |
Surgical scalpel blade No. 21 | Swann-Morton | 307 | |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Trypsin-EDTA (0.5 %) | Gibco | 15400054 |