In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Somatosensatie, de neurale codering van mechanische, thermische en chemische stimuli die inwerken op de huid of andere lichaamsstructuren, waaronder spieren, botten en ingewanden, begint met activiteit in primaire afferente neuronen die deze structuren innerveren1. Elektrofysiologische benaderingen op basis van één eenheid hebben een schat aan informatie opgeleverd over de afferente subtypes die bij dit proces betrokken zijn, evenals hoe hun stimulus-responseigenschappen in de loop van de tijd kunnen veranderen ^1,2,3. Hoewel er sterk bewijs blijft ter ondersteuning van de gelabelde lijntheorie, die suggereert dat specifieke sensorische modaliteiten worden overgebracht door specifieke subpopulatie(s) van neuronen, suggereert het vermogen van veel subpopulaties van neuronen om te reageren op dezelfde soorten mechanische, thermische en chemische stimuli dat de meerderheid van de somatosensorische stimuli wordt gecodeerd door meerdere subpopulaties van neuronen^{4, 5}. okt. Een beter begrip van somatosensatie zal dus alleen komen met de mogelijkheid om de activiteit van 10’s, zo niet honderden neuronen tegelijkertijd te bestuderen.

Vooruitgang in optische benaderingen met de relatief recente komst van confocale en vervolgens multifoton- en digitale beeldvormingstechnieken hebben de mogelijkheid vergemakkelijkt om relatief niet-invasieve analyses op populatieniveau van neuronale activiteit uit te voeren ^6,7. Een van de laatste hindernissen bij de toepassing van deze technologie is de ontwikkeling van hulpmiddelen om de optische beoordeling van neurale activiteit mogelijk te maken. Gezien de snelheid van een actiepotentiaal die in minder dan een milliseconde kan beginnen en eindigen, zou een spanningsgevoelige kleurstof met het vermogen om veranderingen in membraanpotentiaal te volgen met de snelheid van een actiepotentiaal het ideale hulpmiddel voor dit doel zijn. Maar hoewel er enorme vooruitgang is geboekt op dit gebied 7,8,9,10, is de signaal-ruisverhouding voor veel van deze kleurstoffen nog steeds niet hoog genoeg om een populatieanalyse van honderden neuronen op celniveau mogelijk te maken. Als alternatieve benadering hebben onderzoekers zich gericht op het monitoren van veranderingen in de intracellulaire Ca^2+-concentratie ([Ca²⁺]_i). De beperkingen van deze strategie zijn vanaf het begin duidelijk geweest en omvatten het feit dat een toename van [Ca²⁺]_i een indirecte maat is voor neurale activiteit¹¹; dat een toename van [Ca²⁺]_i kan optreden onafhankelijk van de instroom van Ca²⁺ die gepaard gaat met de activering van spanningsafhankelijke Ca²⁺-kanalen (VGCC’s)^12,13; dat de omvang en de duur van een Ca²⁺ transiënt kunnen worden gecontroleerd door processen die onafhankelijk zijn van VGCC-activiteit 11,12,14; en dat het tijdsverloop van Ca²⁺ transiënten veel groter is dan dat van een actiepotentiaal¹⁵. Desalniettemin zijn er een aantal belangrijke voordelen verbonden aan het gebruik van Ca²⁺ als indirecte maat voor neurale activiteit. Niet de minste hiervan is de signaal-ruisverhouding die wordt geassocieerd met de meeste Ca²⁺-indicatoren, die zowel de omvang van de verandering in intracellulaire Ca²⁺ weerspiegelt als het feit dat het signaal voortkomt uit de driedimensionale ruimte van het cytosol in plaats van de tweedimensionale ruimte van het celmembraan. Bovendien is het met de ontwikkeling van genetisch gecodeerde Ca²⁺-indicatoren (GECI’s) mogelijk om te profiteren van genetische strategieën om de expressie van de Ca²⁺-indicatoren in specifieke subpopulaties van cellen te stimuleren, waardoor analyses op populatieniveau in intacte preparaten worden vergemakkelijkt (bijv.^{zie 16}).

Gezien het aantal genetische hulpmiddelen dat nu beschikbaar is in muizen, zou het geen verrassing moeten zijn dat GECI’s het meest op grote schaal zijn gebruikt bij deze soort. Muislijnen met constitutieve GECI-expressie in subpopulaties van sensorische neuronen zijn ontwikkeld ^7,16,17. Met de ontwikkeling van muislijnen die recombinasen tot expressie brengen in specifieke celtypen, is het mogelijk om nog geavanceerdere strategieën te gebruiken om GECI-expressie te beheersen¹⁵. Hoewel deze instrumenten steeds krachtiger worden, zijn er een aantal redenen waarom andere soorten, zoals ratten, geschikter zouden kunnen zijn voor sommige experimentele vragen. Deze omvatten het grotere formaat, waardoor een aantal experimentele manipulaties mogelijk zijn die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn bij de kleinere muis; het gemak waarmee ratten kunnen worden getraind in relatief complexe gedragstaken; en op zijn minst enig bewijs dat biofysische eigenschappen en expressiepatronen van verschillende ionkanalen in sensorische neuronen van ratten meer lijken op die waargenomen in menselijke sensorische neuronen dan dezelfde kanalen in muizen ten opzichte van de mens^.

Hoewel de transductie van somatosensorische stimuli over het algemeen plaatsvindt in de perifere uiteinden van primaire afferenten, moet het actiepotentiaal dat in de periferie wordt geïnitieerd, door de structuur gaan die primaire afferente somata herbergt, ook wel dorsale wortel (DRG) of trigeminus (TG) ganglia genoemd voordat het het centrale zenuwstelsel bereikt¹⁹. Hoewel er aanwijzingen zijn dat niet elke actiepotentiaal die zich voortplant langs een primair afferent axon het cellichaam^{zal binnendringen 20}, een gevolg van het feit dat de primaire afferente somata verbonden zijn met het belangrijkste afferente axon via een T-splitsing¹⁹, lijken de meeste actiepotentialen die in de periferie worden geïnitieerd de soma²¹ binnen te dringen. Dit levert drie experimentele voordelen op bij het gebruik van GECI’s om populatiecodering in primaire afferenten te beoordelen: de grote omvang van het cellichaam ten opzichte van de axonen verhoogt het signaal tot ruis verder bij gebruik van [Ca²⁺]_i als een indirecte maat voor afferente activiteit; de DRG zijn over het algemeen gemakkelijk toegankelijk; En het beoordelen van activiteit op een plaats die ruimtelijk ver verwijderd is van de afferente terminals, minimaliseert de potentiële impact van de operatie die nodig is om de ganglia bloot te leggen op de stimulus-responseigenschappen van de afferente terminals. Omdat TG zich echter onder de hersenen (of boven het palet) bevindt, zijn ze veel moeilijker toegankelijk dan DRG. Bovendien, hoewel er veel overeenkomsten zijn tussen DRG- en TG-neuronen, is er ook een groeiende lijst met verschillen. Dit omvat de ruwweg somatotopische organisatie van neuronen in de TG²², unieke geïnnerveerde structuren, verschillende centrale terminale beëindigingspatronen 23,24,25,26, en nu een groeiende lijst van verschillen in zowel genexpressie^27,28 als functionele receptorexpressie²⁹. Bovendien, omdat we geïnteresseerd zijn in de identificatie van perifere mechanismen van pijn, suggereert het relatief grote aantal pijnsyndromen die uniek lijken te zijn voor het trigeminussysteem (bijv. migraine, trigeminusneuralgie, brandende mondsyndroom) die afwijkende activiteit in primaire afferenten lijken te omvatten 30,31,32, dat de TG rechtstreeks moet worden bestudeerd.

Dus, terwijl stimulus-respons eigenschappen van TG-neuronen zijn bestudeerd met GECI’s in de muis¹⁶, omdat de hierboven genoemde redenen suggereren dat de rat een geschiktere soort kan zijn om een verscheidenheid aan experimentele vragen te beantwoorden, was het doel van de huidige studie om een benadering te ontwikkelen om GECI’s te gebruiken om TG-neuronen in de rat te bestuderen. Om dit te bereiken, gebruikten we een virale benadering om de expressie van de GECI GCaMP6’s in het perifere zenuwstelsel te stimuleren. Vervolgens hebben we de voorhersenen verwijderd om toegang te krijgen tot de TG. Ten slotte werden mechanische en thermische stimuli op het gezicht aangebracht, terwijl neuronale reacties werden beoordeeld onder fluorescerende microscopie. Samen ondersteunen deze gegevens een rol voor het gebruik van de rat om veranderingen in de TG onder veel staten te onderzoeken, waardoor de toolkit wordt uitgebreid voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in sensorische codering in het trigeminussysteem.