体内 大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

躯体感觉是影响皮肤或其他身体结构（包括肌肉、骨骼和内脏）的机械、热和化学刺激的神经编码，始于支配这些结构的初级传入神经元^{的活动 1}。基于单单元的电生理学方法提供了有关该过程所涉及的传入亚型以及它们的刺激反应特性如何随时间变化的大量信息^1,2,3。然而，虽然仍然有强有力的证据支持标记线理论，该理论表明特定的感觉模式是由特定的神经元亚群传达的，但许多神经元亚群对相同类型的机械、热和化学刺激做出反应的能力表明，大多数体感刺激是由多个神经元亚群编码^{的 4，5}.因此，要更好地理解躯体感觉，就必须同时研究10个（如果不是数百个）神经元的活动。

随着最近共聚焦以及随后的多光子和数字成像技术的出现，光学方法的进步促进了对神经元活动进行相对非侵入性群体水平分析的能力^6,7。该技术应用的最后一个障碍是开发能够对神经活动进行光学评估的工具。鉴于动作电位的速度可以在不到一毫秒的时间内开始和结束，能够以动作电位的速度跟踪膜电位变化的电压敏感染料将是实现此目的的理想工具。但是，尽管在^7,8,9,10这一领域取得了巨大进展，但其中许多染料的信噪比仍然不够高，无法在单细胞水平上对数百个神经元进行群体分析。作为替代方法，研究人员已转向监测细胞内 Ca²⁺ 浓度 （[Ca²⁺]_i） 的变化。这种策略的局限性从一开始就很明显，包括 [Ca²⁺]_i 的增加是神经活动的间接测量¹¹;[Ca²⁺]_i 的增加可能与与电压门控 Ca²⁺ 通道 （VGCC） 激活相关的 Ca²⁺ 流入无关^12,13;Ca²⁺瞬变的幅度和持续时间可以由独立于VGCC活动的过程控制11,12,14;并且 Ca²⁺ 瞬变的时间过程远远超过动作电位¹⁵ 的时间过程。然而，使用 Ca²⁺ 作为神经活动的间接测量具有许多显着优势。其中最重要的是与大多数 Ca²⁺ 指标相关的信噪比，它反映了细胞内 Ca²⁺ 变化的幅度以及信号来自胞质溶胶的三维空间而不是细胞膜的二维空间这一事实。此外，随着遗传编码的 Ca²⁺ 指示剂 （GECI） 的发展，可以利用遗传策略来驱动 Ca²⁺ 指示剂在特定细胞亚群中的表达，从而促进完整制剂中的群体水平分析（例如，参见¹⁶）。

鉴于现在在小鼠中可用的遗传工具的数量，GECI在该物种中被最广泛地使用也就不足为奇了。在感觉神经元亚群中具有组成型 GECI 表达的小鼠系已被开发出来 ^7,16,17。随着在特定细胞类型中表达重组酶的小鼠品系的发展，可以使用更复杂的策略来控制GECI表达¹⁵。然而，虽然这些工具越来越强大，但有很多原因可以解释为什么其他物种，如老鼠，可能更适合一些实验问题。这些包括更大的尺寸，促进了许多实验操作，这些操作在较小的小鼠中是困难的，如果不是不可能的话;训练大鼠完成相对复杂的行为任务的便利性;至少有一些证据表明，大鼠感觉神经元中几种离子通道的生物物理特性和表达模式可能与在人类感觉神经元中观察到的更相似，而不是在小鼠中相对于人类¹⁸的相同通道。

虽然躯体感觉刺激的转导通常发生在初级传入神经的外周末梢，但在外周启动的动作电位必须通过容纳初级传入体细胞的结构，称为背根 （DRG） 或三叉神经 （TG） 神经节，然后才能到达中枢神经系统¹⁹。虽然有证据表明，并非每个沿初级传入轴突传播的动作电位都会侵入细胞体²⁰，这是由于初级传入体体通过T型连接¹⁹连接到主传入轴突，因此在外周启动的大多数动作电位似乎侵入了体细胞²¹.当使用 GECI 评估初级传入细胞中的群体编码时，这赋予了三个实验优势：当使用 [Ca²⁺]_i 作为传入活动的间接测量时，相对于轴突的细胞体尺寸较大，进一步增加了信噪比;DRG 通常易于访问;在空间上远离传入末梢的部位评估活动，可以最大限度地减少暴露神经节所需的手术对传入末梢刺激-反应特性的潜在影响。然而，由于 TG 位于大脑下方（或调色板上方），因此它们比 DRG 更难获得。此外，虽然 DRG 和 TG 神经元之间有许多相似之处，但差异也越来越多。这包括 TG²² 中神经元的大致体位组织、支配的独特结构、不同的中央末端终止模式^{23、24、25、26}，以及现在基因表达^27,28 和功能受体表达²⁹ 的越来越多的差异列表.此外，由于我们对疼痛的外周机制的鉴定感兴趣，因此似乎有大量三叉神经系统特有的疼痛综合征（例如，偏头痛、三叉神经痛、灼口综合征）似乎涉及初级传入神经的异常活动^30,31,32，这表明需要直接研究 TG。

因此，虽然已经用小鼠 GECI 研究了 TG 神经元的刺激-反应特性¹⁶，但由于上面列出的原因表明大鼠可能是更适合解决各种实验问题的物种，本研究的目的是开发一种使用 GECI 研究大鼠 TG 神经元的方法。为了实现这一目标，我们利用病毒方法来驱动 GECI GCaMP6 在周围神经系统中的表达。然后，我们移除了前脑以允许访问TG。最后，将机械和热刺激施加到面部，同时在荧光显微镜下评估神经元反应。总之，这些数据支持利用大鼠在许多状态下研究 TG 的变化，为对三叉神经系统中的感觉编码感兴趣的研究人员扩展了工具包。