قياس الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون
Summary
يقدم هذا البروتوكول مقايسة لنمذجة الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة القائم على ألفا سينوكلين لمرض باركنسون.
Abstract
الأعراض غير الحركية في مرض باركنسون (PD) شائعة ويصعب علاجها وتضعف بشكل كبير نوعية الحياة. أحد الأعراض غير الحركية السائدة هو الإمساك ، والذي يمكن أن يسبق تشخيص مرض باركنسون بسنوات أو حتى عقود. لم يتم استكشاف الإمساك بشكل كاف في النماذج الحيوانية لمرض باركنسون ويفتقر إلى علاجات محددة. يستخدم هذا الفحص نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون حيث يتم التعبير عن ألفا سينوكلين البشري تحت محرك الخلايا العصبية الشاملة. الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين يطور السمات المميزة لمرض باركنسون: فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية ، والضعف الحركي ، وشوائب ألفا سينوكلين.
يحدد هذا البروتوكول طريقة لدراسة الإمساك في هذه الذباب. يتم وضع الذباب على طعام الذباب مع مادة مضافة زرقاء اللون طوال الليل ثم يتم نقله إلى الطعام القياسي في اليوم التالي. يتم نقلهم بعد ذلك إلى قوارير جديدة مع طعام ذبابة قياسي كل ساعة لمدة 8 ساعات. قبل كل عملية نقل ، يتم حساب النسبة المئوية للبقع البرازية ذات اللون الأزرق مقارنة بإجمالي بقع البراز على جدار القارورة. الذباب الضابط الذي يفتقر إلى ألفا سينوكلين يطرد جميع الصبغة الزرقاء قبل ساعات من الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مراقبة مرور الطعام ذو اللون الأزرق من القناة الهضمية من خلال التصوير الفوتوغرافي البسيط. تتيح بساطة هذا الفحص استخدامه في الشاشات الجينية أو الكيميائية الأمامية لتحديد معدلات الإمساك في ذبابة الفاكهة.
Introduction
مرض باركنسون (PD) هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يتميز سريريا بوجود أعراض حركية مثل بطء الحركة والصلابة والهزة ، مما يؤدي إلى اعتلال كبير1. من الناحية المرضية ، يتم تعريف PD من خلال فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء واختلال ألفا سينوكلين ، مما يؤدي إلى تكوين أجسام ليوي وخلايا ليوي العصبية. لا يزال التسبب في مرض باركنسون غير مفهوم بشكل جيد ، ومن المحتمل أن ينشأ عن تفاعل معقد للعوامل الوراثية والبيئية 2,3. حاليا ، العلاجات المعدلة للمرض غير متوفرة ، ربما يرجع ذلك جزئيا إلى المرحلة المتقدمة من علم الأمراض الموجودة في وقت التشخيص. أظهرت الدراسات أن أكثر من 60٪ من الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء قد فقدت بالفعل بسبب ظهور الأعراض الحركية ، مما يؤكد الحاجة إلى استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة للكشف المبكر عن المرض4. أحد هذه العلامات الحيوية السريرية هو الإمساك ، وهو أمر شائع في مرضى PD 5,6 وقد يسبق ظهور الأعراض الحركية بسنوات أو حتى عقود.
على الرغم من التعريف السريري لمرض باركنسون القائم على الأعراض الحركية ، فإن الإمساك هو واحد من العديد من الأعراض غير الحركية التي يصعب علاجها من الأعراض وتسبب ضعفا كبيرا في نوعية حياة المرضى7. وقد تورطت التغيرات في محور الأمعاء والدماغ ، والذي يمثل الاتصال ثنائي الاتجاه بين الدماغ والجهاز العصبي المعوي ، في التسبب في مرض PD. تم العثور على مجاميع ألفا سينوكلين في عينات الأنسجة من المسالك المعدية المعوية لمرضى باركنسون8 ، وتشير النماذج الحيوانية إلى أن مجاميع ألفا سينوكلين في الجهاز العصبي المعوي تنتشر بطريقة تشبه البريون إلى الجهاز العصبي المركزي9. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر مرضى PD تشوهات في ميكروبيوم الأمعاء10 وقد يعانون من التهاب الأمعاء المفرط11. لم تتم دراسة الإمساك في مرض باركنسون ، مع الإبلاغ عن عدد قليل من نماذج الإمساك المرتبط بمرض باركنسون في الذباب12،13أو القوارض14،15.
يستخدم هذا الفحص نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون حيث يعبر الذباب عن جين ألفا سينوكلين البشري تحت سيطرة سائق الخلايا العصبية الشاملة ، n-synaptobrevin. تظهر هذه الذباب جميع السمات المميزة لمرض باركنسون ، بما في ذلك تراكم ألفا سينوكلين ، والخلل الحركي ، والتنكس العصبي المرتبط بالعمر ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية16,17. أدخلت الدراسات السابقة قياس ناتج البراز في الذباب لتقييم اختلال وظائف الأمعاء ، وتحديد كمية براز الذباب ومقارنة كميات الفضلات عبر الخطوط الجينية المختلفة للكشف عن الاختلافات الوظيفية في الجهاز الهضمي18،19،20. هنا ، نوضح مقايسة الإمساك باستخدام الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري. تتيح هذه الأداة البسيطة والقيمة دراسة أحد الأعراض غير الحركية المهمة لمرض باركنسون.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول التي ستساعد في إكمال الفحص بنجاح. أولا ، من المهم التأكد من أن الفترات الزمنية بين كل جولة لكل قارورة متسقة طوال التجربة. سيساعد وضع علامات على القوارير بالأرقام على تجنب الحاجة إلى أوصاف طويلة للنمط الوراثي ، مما يوفر الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، من الأهمية بمكان أن تظل طريقة حساب البراز22 متسقة طوال التجربة. في حين أن البراز الأزرق مرئي على سدادة الطعام والقارورة ، فإن البراز عديم اللون ليس كذلك. لذلك ، لا تحسب النقاط الزرقاء على الطعام أو سدادة القارورة.
مع المقايسات السلوكية ، هناك دائما احتمال وجود تناقضات في النتائج بسبب التقلبات في سلوك الذباب أو المتغيرات غير المعروفة التي تؤثر على الفحص. نوصي باستخدام نفس وسائط ذبابة الفاكهة ، ونفس صبغة الطعام ، ونفس العلامة التجارية للقوارير لجميع التجارب. ومن المثير للاهتمام ، في العديد من التجارب ، لوحظ أن الذباب يميل إلى التغوط بشكل أقل تواترا في وقت مبكر من بعد الظهر ، ربما بسبب إيقاع الذباب اليومي23. ومع ذلك ، فإن هذا السلوك ثابت في كل من الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين ، لذلك لا ينبغي أن يثير المخاوف.
إذا كان الذباب لا يفرز البراز الأزرق في بداية الفحص ، فمن المحتمل أن الصبغة المستخدمة ليست مصطبغة بدرجة كافية. في هذه الحالة ، يمكن للمرء زيادة نسبة الصبغة إلى الماء المقطر وفقا لذلك. من الممكن أيضا أنه عندما لا يتبقى سوى كمية صغيرة من الطعام الأزرق في الجهاز الهضمي للذبابة ، فقد يكون من الصعب تحديد ما إذا كانت المادة البرازية زرقاء شاحبة أو عديمة اللون. عندما يحدث هذا ، فإن وضع ورقة بيضاء خلف القارورة سيساعد في تحديد لون النقطة البرازية. حتى لو كانت المادة البرازية زرقاء فاتحة جدا ، فمن الأفضل تسجيلها كبراز أزرق بدلا من مادة برازية عديمة اللون.
أحد قيود هذا الفحص هو أنه يتطلب العد اليدوي للبقع البرازية. ولتحسين إمكانية الفحص عالي الإنتاجية، يمكن تعديل هذا البروتوكول في المستقبل للسماح بالقياس الكمي الآلي للبقع البرازية الزرقاء التي ينتجها الذباب الفردي في ألواح متعددة الآبار. هناك قيد آخر وهو أنه على الرغم من أن نموذج ألفا سينوكلين لديه القدرة على تطويره إلى نموذج بادري لمرض باركنسون ، إلا أنه لم يتم بعد تحديد النقطة الزمنية المثلى التي يوجد فيها الإمساك دون تنكس عصبي.
باختصار ، تقدم هذه الطريقة نهجا بسيطا ومباشرا لنمذجة الإمساك ، وهو أحد أعراض PD غير الحركية غير المدروسة ، في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر الدكتور ميل فياني في مستشفى بريغهام والنساء وكلية الطب بجامعة هارفارد على الهدية الكريمة للتحكم وألفا سينوكلين التي تعبر عن خطوط ذبابة الفاكهة . نحن نعترف بالمصادر التالية لدعم المنح للدكتور أولسن: NINDS K08 ، زمالة جمعية مرض باركنسون الأمريكية جورج سي كوتزياس ، جائزة الباحث المبكر لمرض باركنسون بوزارة الدفاع.
Materials
| 1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
| 68 L water | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
| 6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
| 800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
| cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
| Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
| Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
| Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
| Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
| Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Drosophila Stocks | |||
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
Referenzen
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. Parkinson’s disease. Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).
- Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. Parkinson’s disease and the environment. Front Neurol. 10, 218 (2019).
- Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson’s disease. NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116 (2021).
- Ueki, A., Otsuka, M. Life style risks of Parkinson’s disease: association between decreased water intake and constipation. J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).
- Houser, M. C., Tansey, M. G. The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson’s disease pathogenesis. NPJ Parkinsons Dis. 3, 3 (2017).
- Pfeiffer, R. F. Non-motor symptoms in Parkinson’s disease. Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).
- Klann, E. M., et al. The Gut-brain axis and its relation to parkinson’s disease: A review. Front Aging Neurosci. 13, 782082 (2021).
- Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. Gut dysfunction in Parkinson’s disease. World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).
- Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. Parkinson’s disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).
- Chen, S. J., Lin, C. H. Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson’s disease through the gut-brain axis. J Biomed Sci. 29 (1), 54 (2022).
- Hawrysh, P. J., et al. PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis. Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).
- Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson’s disease in Drosophila. Transl Neurodegener. 11 (1), 44 (2022).
- Rota, L., et al. Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy. Transl Neurodegener. 8, 5 (2019).
- Diwakarla, S., et al. ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson’s disease. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).
- Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton. Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).
- Olsen, A. L., Feany, M. B. Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo. Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output. J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).
- Popovic, R., et al. Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Cell Death Dis. 14 (3), 206 (2023).
- Poteet, E., et al. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One. 7 (10), e48279 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetik. 210 (2), 357-396 (2018).
- Schlichting, M., et al. A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
