Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos
Summary
O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.
Abstract
A exocitose acrossômica (AE), na qual a única vesícula exocitótica do espermatozoide se funde com a membrana plasmática, é um processo complexo, cálcio-dependente, essencial para a fecundação. No entanto, nossa compreensão de como a sinalização do cálcio regula o EA ainda é incompleta. Em particular, a interação entre a dinâmica intra-acrossomal do cálcio e as etapas intermediárias que levam ao EA não é bem definida. Aqui, descrevemos um método que fornece informações espaciais e temporais sobre a dinâmica do cálcio acrossomal e sua relação com a fusão de membrana e subsequente exocitose da vesícula acrossomal. O método utiliza um novo camundongo transgênico expressando um sensor para exocitose (AcroSensE) direcionado a um acrossoma. O sensor combina um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP) fundido com mCherry. Esta proteína de fusão foi projetada especificamente para permitir a observação simultânea da dinâmica do cálcio acrossomal e eventos de fusão de membrana. O monitoramento em tempo real da dinâmica do cálcio acrossomal e AE em espermatozoides vivos AcroSensE é obtido usando uma combinação de imagens de alta taxa de quadros e um sistema de entrega de estimulantes que pode atingir um único espermatozoide. Este protocolo também fornece vários exemplos de métodos básicos para quantificar e analisar os dados brutos. Como o modelo AcroSensE é codificado geneticamente, seu significado científico pode ser aumentado usando ferramentas genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou métodos baseados em edição genética (CRISPR). Com essa estratégia, os papéis de vias de sinalização adicionais na capacitação e fertilização espermática podem ser resolvidos. Em resumo, o método descrito aqui fornece uma ferramenta conveniente e eficaz para estudar a dinâmica do cálcio em um compartimento subcelular específico – o acrossoma espermático – e como essas dinâmicas regulam as etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e à exocitose acrossomal.
Introduction
Os espermatozoides adquirem a capacidade de fecundar durante um processo chamado capacitação1. Um ponto final desse processo é que os espermatozoides adquirem a capacidade de sofrer EA. Mais de duas décadas de dados suportam a presença de um modelo complexo e de várias etapas de EA em espermatozoides de mamíferos (resumido em 2,3). No entanto, estudar EA em espermatozoides vivos é um desafio, e os métodos atualmente disponíveis para monitorar esse processo com resolução adequada são complicados e requerem várias etapas de preparação4, são limitados à detecção da etapa final do EA (por exemplo, usando PNA5), são limitados a medidas de alterações no cálcio citosólico (em contraste com a dinâmica do cálcio acrossomal), ou limitam-se a medidas da dinâmica citosólica do cálcio ou AE6.
Para superar algumas das principais limitações dos estudos de EA em tempo real sob condições fisiológicas e permitir a investigação da interação entre a dinâmica do cálcio e EA, um modelo único de camundongo foi gerado. Neste modelo de camundongo, uma proteína de fusão composta pelo sensor Ca2+ codificado geneticamente (GCaMP3) e mCherry é expressa e direcionada para o acrossoma usando um promotor de acrosina e peptídeo de sinalização2. O sensor duplo GCaMP3-mCherry direcionado permite medições simultâneas em tempo real das concentrações de cálcio e do estado do conteúdo acrossomal em espermatozoides vivos em condições fisiológicas usando microscopia e um sistema de liberação de estimulante de célula única (Figura 1). Como componente da matriz acrisomal, a fusão da membrana e o AE resultariam na perda da fluorescência mCherry fotosestável e insensível ao pH do espermatozoide, uma vez que essa proteína se difunde para fora da vesícula do acrossoma. Nesse sentido, a capacidade do modelo de refletir o momento e a ocorrência de EA é semelhante aos benefícios da linhagem de camundongos GFP direcionada para acrossoma7,8,9.
A variante GCaMP3 usada nesta linha de camundongos transgênicos tem um KD aproximado de 400 μM e uma faixa dinâmica para Ca2+ de 10-4-10-3 M10, o que é adequado para esta vesícula. Mostramos que essa combinação de características da GCaMP3 poderia revelar a formação de poros de fusão entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal externa (MAO)2. A detecção de poros de fusão é resultado do tamanho dos poros ser muito pequeno para permitir que a proteína AcroSensE se disperse para fora do acrossoma (através da perda de conteúdo acrossomo) enquanto fornece um “canal” de membrana que permite o influxo de íons Ca2+ no lúmen acrossomo, levando a um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP3.
A proteína fluorescente brilhante, monomérica e não sensível ao cálcio mCherry suporta a visualização do acrossoma enquanto o sinal GCaMP3 é fraco (por exemplo, antes da ligação de Ca2+ , Figura 2) e, importante, também permite a identificação de espermatozoides intactos de acrossoma adequados para exames de imagem.
O protocolo a seguir descreve a utilização do modelo único de camundongos AcroSensE e os métodos de microscopia usados experimentalmente para estudar a dinâmica do cálcio espermático e AE com alta resolução espacial e temporal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um método baseado em microscopia é descrito para utilizar o modelo de camundongo AcroSensE recém-gerado para monitoramento em tempo real, de célula única e análise da interação entre a dinâmica do cálcio acrossomal e as etapas intermediárias que levam ao EA. Juntamente com abordagens genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou edição de genes, este modelo e método fornecem um sistema poderoso para estudar o papel de vários componentes e vias qu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
Referenzen
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