Imaging in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'esocitosi in spermatozoi di topo vivi
Summary
Il modello murino AcroSensE e i metodi di imaging di cellule vive qui descritti forniscono un nuovo approccio allo studio della dinamica del calcio nel compartimento subcellulare dell’acrosoma spermatico e di come regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all’esocitosi dell’acrosoma.
Abstract
L’esocitosi acrosomica (AE), in cui la singola vescicola esocitotica dello spermatozoo si fonde con la membrana plasmatica, è un processo complesso e calcio-dipendente essenziale per la fecondazione. Tuttavia, la nostra comprensione di come la segnalazione del calcio regoli l’AE è ancora incompleta. In particolare, l’interazione tra la dinamica del calcio intra-acrosomiale e le fasi intermedie che portano all’AE non è ben definita. Qui, descriviamo un metodo che fornisce approfondimenti spaziali e temporali sulla dinamica del calcio acrosomiale e sulla loro relazione con la fusione di membrana e la successiva esocitosi della vescicola acrosomiale. Il metodo utilizza un nuovo topo transgenico che esprime un sensore per l’esocitosi mirato all’acrosoma (AcroSensE). Il sensore combina un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP) fuso con mCherry. Questa proteina di fusione è stata specificamente progettata per consentire l’osservazione simultanea della dinamica del calcio acrosomiale e degli eventi di fusione della membrana. Il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell’AE negli spermatozoi vivi AcroSensE si ottiene utilizzando una combinazione di imaging ad alta frequenza di fotogrammi e un sistema di somministrazione stimolante in grado di colpire singoli spermatozoi. Questo protocollo fornisce anche diversi esempi di metodi di base per quantificare e analizzare i dati grezzi. Poiché il modello AcroSensE è geneticamente codificato, il suo significato scientifico può essere aumentato utilizzando strumenti genetici prontamente disponibili, come l’incrocio con altri modelli genetici murini o metodi basati sull’editing genetico (CRISPR). Con questa strategia, è possibile risolvere il ruolo di ulteriori vie di segnalazione nella capacitazione e nella fecondazione degli spermatozoi. In sintesi, il metodo qui descritto fornisce uno strumento conveniente ed efficace per studiare la dinamica del calcio in uno specifico compartimento subcellulare – l’acrosoma spermatico – e come tali dinamiche regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all’esocitosi dell’acrosoma.
Introduction
Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di fecondare durante un processo chiamato capacitazione1. Un endpoint di questo processo è che gli spermatozoi acquisiscono la capacità di sottoporsi a AE. Oltre due decenni di dati supportano la presenza di un modello complesso e multi-step di AE negli spermatozoi dei mammiferi (riassunto in 2,3). Tuttavia, lo studio dell’AE negli spermatozoi vivi è impegnativo e i metodi attualmente disponibili per monitorare questo processo con una risoluzione adeguata sono ingombranti e richiedono più fasi di preparazione4, sono limitati al rilevamento della fase finale dell’AE (ad esempio, utilizzando PNA5), sono limitati alle misurazioni dei cambiamenti nel calcio citosolico (in contrasto con la dinamica del calcio acrosomiale), o sono limitati alle misurazioni della dinamica del calcio citosolico o dell’AE6.
Per superare alcuni dei limiti chiave degli studi di eventi avversi in tempo reale in condizioni fisiologiche e per consentire lo studio dell’interazione tra la dinamica del calcio e l’evento avverso, è stato generato un modello murino unico. In questo modello murino, una proteina di fusione composta dal sensore Ca2+ geneticamente codificato (GCaMP3) e mCherry viene espressa e indirizzata all’acrosoma utilizzando un promotore dell’acrosina e un peptidedi segnalazione 2. Il doppio sensore GCaMP3-mCherry consente di misurare simultaneamente in tempo reale le concentrazioni di calcio e lo stato del contenuto acrosomiale negli spermatozoi vivi in condizioni fisiologiche utilizzando la microscopia e un sistema di somministrazione di stimolanti a singola cellula (Figura 1). Come componente della matrice acrosomiale, la fusione della membrana e l’AE comporterebbero la perdita della fluorescenza fotostabile e insensibile al pH mCherry dallo sperma, poiché questa proteina si diffonde fuori dalla vescicola acrosomiale. A questo proposito, la capacità del modello di riflettere la tempistica e l’occorrenza dell’AE è simile ai benefici della lineamurina GFP mirata all’acrosoma 7,8,9.
La variante GCaMP3 utilizzata in questa linea di topi transgenici ha un KD approssimativo di 400 μM e un intervallo dinamico per Ca2+ di 10-4-10-3 M10, che è adatto a questa vescicola. Abbiamo dimostrato che questa combinazione di caratteristiche di GCaMP3 potrebbe rivelare la formazione di pori di fusione tra la membrana plasmatica e la membrana acrosomiale esterna (OAM)2. Il rilevamento dei pori di fusione è il risultato del fatto che la dimensione dei pori è troppo piccola per consentire alla proteina AcroSensE di disperdersi fuori dall’acrosoma (attraverso la perdita di contenuto dell’acrosoma), fornendo al contempo un “canale” di membrana che consente l’afflusso di ioni Ca2+ nel lume dell’acrosoma, portando ad un aumento dell’intensità di fluorescenza del GCaMP3.
La proteina fluorescente mCherry, luminosa, monomerica e non sensibile al calcio, supporta la visualizzazione dell’acrosoma mentre il segnale GCaMP3 è debole (ad esempio, prima del legame con Ca2+ , Figura 2) e, soprattutto, consente anche l’identificazione di spermatozoi intatti dell’acrosoma adatti per l’imaging.
Il seguente protocollo descrive l’utilizzo dell’esclusivo modello murino AcroSensE e i metodi per la microscopia utilizzati sperimentalmente per studiare la dinamica degli eventi avversi e del calcio degli spermatozoi con un’elevata risoluzione spaziale e temporale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, viene descritto un metodo basato sulla microscopia per utilizzare il modello murino AcroSensE appena generato per il monitoraggio in tempo reale di una singola cellula e l’analisi dell’interazione tra la dinamica del calcio acrosomiale e i passaggi intermedi che portano all’AE. Insieme ad approcci genetici prontamente disponibili, come l’incrocio con altri modelli genetici murini o l’editing genetico, questo modello e metodo forniscono un potente sistema per studiare il ruolo di vari componenti e percorsi che prendo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T) del National Institutes of Health.
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
Referenzen
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