Imagerie en temps réel de la dynamique acrosomique du calcium et de l’exocytose dans les spermatozoïdes de souris vivants
Summary
Le modèle murin AcroSensE et les méthodes d’imagerie de cellules vivantes décrits ici offrent une nouvelle approche pour étudier la dynamique du calcium dans le compartiment subcellulaire de l’acrosome des spermatozoïdes et comment ils régulent les étapes intermédiaires menant à la fusion membranaire et à l’exocytose de l’acrosome.
Abstract
L’exocytose de l’acrosome (AE), dans laquelle la vésicule exocytotique unique du spermatozoïde fusionne avec la membrane plasmique, est un processus complexe, dépendant du calcium, essentiel à la fécondation. Cependant, notre compréhension de la façon dont la signalisation calcique régule l’AE est encore incomplète. En particulier, l’interaction entre la dynamique calcique intra-acrosomique et les étapes intermédiaires menant à l’EI n’est pas bien définie. Nous décrivons ici une méthode qui fournit des informations spatiales et temporelles sur la dynamique acrosomique du calcium et sa relation avec la fusion membranaire et l’exocytose subséquente de la vésicule acrosomique. La méthode utilise une nouvelle souris transgénique exprimant un capteur d’exocytose ciblant l’acrosome (AcroSensE). Le capteur combine un indicateur de calcium génétiquement codé (GCaMP) fusionné avec mCherry. Cette protéine de fusion a été spécialement conçue pour permettre l’observation simultanée de la dynamique acrosomique du calcium et des événements de fusion membranaire. La surveillance en temps réel de la dynamique acrosomale du calcium et de l’EI dans les spermatozoïdes vivants d’AcroSensE est réalisée à l’aide d’une combinaison d’imagerie à fréquence d’images élevée et d’un système d’administration stimulant qui peut cibler un seul spermatozoïde. Ce protocole fournit également plusieurs exemples de méthodes de base pour quantifier et analyser les données brutes. Étant donné que le modèle AcroSensE est génétiquement codé, son importance scientifique peut être augmentée en utilisant des outils génétiques facilement disponibles, tels que le croisement avec d’autres modèles génétiques de souris ou des méthodes basées sur l’édition de gènes (CRISPR). Grâce à cette stratégie, les rôles des voies de signalisation supplémentaires dans la capacitation et la fécondation des spermatozoïdes peuvent être résolus. En résumé, la méthode décrite ici fournit un outil pratique et efficace pour étudier la dynamique du calcium dans un compartiment subcellulaire spécifique – l’acrosome des spermatozoïdes – et comment cette dynamique régule les étapes intermédiaires menant à la fusion membranaire et à l’exocytose de l’acrosome.
Introduction
Les spermatozoïdes acquièrent la capacité de féconder au cours d’un processus appelé capacitation1. L’un des points d’évaluation de ce processus est que les spermatozoïdes acquièrent la capacité de subir un EI. Plus de deux décennies de données confirment la présence d’un modèle complexe d’EI en plusieurs étapes dans les spermatozoïdes de mammifères (résumé en 2,3). Cependant, l’étude de l’EI dans les spermatozoïdes vivants est difficile, et les méthodes actuellement disponibles pour surveiller ce processus avec une résolution adéquate sont lourdes et nécessitent de multiples étapes de préparation4, sont limitées à la détection de l’étape finale de l’EI (par exemple, à l’aide de PNA5), sont limitées aux mesures des changements dans le calcium cytosolique (contrairement à la dynamique acrosomale du calcium), ou sont limités à des mesures de la dynamique du calcium cytosolique ou de l’AE6.
Afin de surmonter certaines des principales limites des études d’EI en temps réel dans des conditions physiologiques et d’étudier l’interaction entre la dynamique du calcium et l’AE, un modèle murin unique a été généré. Dans ce modèle murin, une protéine de fusion composée du capteur Ca2+ (GCaMP3) et de mCherry est exprimée et ciblée sur l’acrosome à l’aide d’un promoteur d’acrosine et d’un peptide de signalisation2. Le double capteur ciblé GCaMP3-mCherry permet de mesurer simultanément en temps réel les concentrations de calcium et l’état du contenu acrosomique dans les spermatozoïdes vivants dans des conditions physiologiques à l’aide de la microscopie et d’un système d’administration de stimulants unicellulaires (Figure 1). En tant que composant de la matrice acrosomique, la fusion membranaire et l’AE entraîneraient la perte de la fluorescence mCherry photostable et insensible au pH du spermatozoïde, car cette protéine diffuse hors de la vésicule acrosomique. À cet égard, la capacité du modèle à refléter le moment et l’occurrence de l’EI s’apparente aux avantages de la lignée de souris GFPciblant l’acrosome 7,8,9.
La variante GCaMP3 utilisée dans cette lignée de souris transgéniques a un KD approximatif de 400 μM et une plage dynamique pour Ca2+ de 10-4-10-3 M10, ce qui convient à cette vésicule. Nous avons montré que cette combinaison de caractéristiques de GCaMP3 pouvait révéler la formation de pores de fusion entre la membrane plasmique et la membrane acrosomique externe (OAM)2. La détection des pores de fusion est le résultat du fait que la taille des pores est trop petite pour permettre à la protéine AcroSensE de se disperser hors de l’acrosome (via la perte de contenu en acrosome) tout en fournissant un « canal » membranaire qui permet l’afflux d’ions Ca2+ dans la lumière de l’acrosome, conduisant à une augmentation de l’intensité de fluorescence du GCaMP3.
La protéine fluorescente mCherry, brillante et monomère et non sensible au calcium, permet de visualiser l’acrosome lorsque le signal GCaMP3 est faible (par exemple, avant la liaison au Ca2+ , Figure 2) et, surtout, elle permet également d’identifier des spermatozoïdes intacts dans l’acrosome adaptés à l’imagerie.
Le protocole suivant décrit l’utilisation du modèle murin unique AcroSensE et les méthodes de microscopie utilisées expérimentalement pour étudier la dynamique de l’AE et du calcium des spermatozoïdes avec une haute résolution spatiale et temporelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, une méthode basée sur la microscopie est décrite pour utiliser le modèle de souris AcroSensE nouvellement généré pour la surveillance et l’analyse en temps réel d’une cellule unique et l’analyse de l’interaction entre la dynamique acrosomique du calcium et les étapes intermédiaires menant à l’AE. Associés à des approches génétiques facilement accessibles, telles que le croisement avec d’autres modèles génétiques murins ou l’édition de gènes, ce modèle et cette méthode fournissent …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par les subventions R01-HD093827 et R03-HD090304 (A.J.T.) des National Institutes of Health.
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
Referenzen
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