Оптическая очистка и маркировка для световой флуоресцентной микроскопии при крупномасштабной визуализации головного мозга человека
Summary
Настоящий протокол обеспечивает пошаговую процедуру быстрой и одновременной оптической очистки, многократного мечения и объемной 3D-реконструкции десятков посмертных срезов мозга человека путем комбинирования (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-тиодиэтанол [TDE]) короткого метода трансформации тканей с визуализацией флуоресцентной микроскопии со световым листом в стандартном протоколе с высокой пропускной способностью.
Abstract
Несмотря на многочисленные методы очистки, появившиеся в последнее десятилетие, обработка посмертного человеческого мозга остается сложной задачей из-за его размеров и сложности, которые делают визуализацию с микрометровым разрешением особенно сложной. В данной работе представлен протокол реконструкции объемных участков головного мозга человека путем одновременной обработки десятков срезов протоколом тканевой трансформации SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]), который позволяет очищать, маркировать и последовательно визуализировать образцы с помощью световой флуоресцентной микроскопии (LSFM). SHORT обеспечивает быстрое очищение тканей и однородное множественное мечение толстых срезов несколькими нейрональными маркерами, что позволяет идентифицировать различные субпопуляции нейронов как в белом, так и в сером веществе. После очистки срезы визуализируются с помощью LSFM с микрометровым разрешением и по нескольким каналам одновременно для быстрой 3D-реконструкции. Комбинируя SHORT с LSFM-анализом в рамках протокола с высокой пропускной способностью, можно получить 3D-реконструкцию цитоархитектуры больших объемных областей с высоким разрешением за короткое время, что позволяет получить всестороннюю структурную характеристику мозга человека.
Introduction
Анализ 3D-молекулярной организации и цитоархитектоники больших объемов человеческого мозга требует оптической прозрачности образцов, достигаемой с помощью протоколов с длительным временем обработки. Методы оптической очистки были разработаны для минимизации гетерогенности показателя преломления (RI) в тканях, тем самым уменьшая рассеяние света и увеличивая глубину проникновения света для визуализации с высоким разрешением 1,2,3,4,5. Современные достижения в области методов очистки и мечения глубоких тканей позволяют проводить объемную визуализацию неповрежденных органов и эмбрионов грызунов с использованием передовых методов микроскопии 6,7,8,9,10,11,12.
Тем не менее, объемная 3D-реконструкция больших участков посмертного человеческого мозга по-прежнему представляет собой сложную задачу по сравнению с модельными организмами. Сложный биологический состав и различные условия посмертной фиксации и хранения могут поставить под угрозу эффективность очистки тканей, глубину проникновения антител и распознавание эпитопов 13,14,15,16,17,18,19. Кроме того, механическое сечение тканей и последующая очистка и маркировка каждого среза по-прежнему требуется для достижения эффективной очистки и равномерного мечения больших областей человеческого мозга, что приводит к длительному времени обработки и необходимости сложного специального оборудования по сравнению с модельными организмами 15,20,21,22.
Методика тканевой трансформации SWITCH – H2O2 – антигена Retrieval –TDE (SHORT) была разработана специально для анализа больших объемов головного мозга человека18,23. Этот метод использует сохранение структуры тканей по протоколу SWITCH11 и высокие концентрации перекиси водорода для уменьшения автофлуоресценции тканей в сочетании с восстановлением эпитопов. SHORT позволяет равномерно окрашивать срезы головного мозга человека маркерами для различных подтипов нейронов, глиальных клеток, сосудов и миелинизированных волокон18,24. Его результаты совместимы с анализом белков как низкой, так и высокой плотности. Полученные высокие уровни прозрачности и равномерная маркировка позволяют проводить объемную реконструкцию толстых срезов с помощью флуоресцентной микроскопии, в частности, для быстрого получения светового листа могут быть использованы приборы 18,24,25,26,27.
В данной работе мы описываем, как техника тканевой трансформации SHORT может быть использована для одновременной очистки и многораундового мечения десятков фиксированных формалином участков человеческого мозга. Четыре различных флуоресцентных маркера могут использоваться вместе, что приводит к идентификации различных клеточных субпопуляций. После очистки можно выполнить объемную визуализацию высокого разрешения с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы использовали изготовленную на заказ инвертированную LSFM 18,24,25,26,27, которая обеспечивает быстрое оптическое секционирование образца и быстрый параллельный захват нескольких каналов. С помощью этого протокола с высокой пропускной способностью можно получить всестороннюю клеточную и структурную характеристику с субклеточным разрешением больших областей человеческого мозга, как это уже было продемонстрировано при картировании всей области Брока23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация с высоким разрешением и 3D-реконструкция больших областей человеческого мозга требуют механического среза тканей с последующим оптическим очищением и иммунометированием отдельных срезов. Протокол, представленный здесь, описывает, как метод трансформации тканей SHORT може?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Брюса Фишля (Bruce Fischl), Массачусетская больница общего профиля, Центр биомедицинской визуализации им. А.А. Мартиноса, отделение радиологии, за предоставление образцов человеческого мозга, проанализированных в этом исследовании. Этот проект получил финансирование от Рамочной программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 654148 (Laserlab-Europe), от Рамочной программы Европейского Союза по исследованиям и инновациям «Горизонт 2020» в рамках Специального грантового соглашения No 785907 (Проект «Мозг человека» SGA2) и No 945539 (Проект «Мозг человека» SGA3), от Центра корпорации больниц общего профиля Национальных институтов здравоохранения под номером U01 MH117023, и от Министерства образования Италии в рамках Итальянского узла Euro-Bioimaging (исследовательская инфраструктура ESFRI). Наконец, это исследование было проведено при участии «Fondazione CR Firenze». Содержание этой работы является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
Referenzen
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
