소뇌 기능에 대한 갑상선 호르몬 효과를 조사하기 위한 다양한 행동 방법
Summary
여기에서는 최근에 개발된 다양한 동작 테스트인 래더 빔 테스트를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 검사는 중추신경계의 갑상선 호르몬 작용 결함으로 인한 미묘한 소뇌 운동 실조증을 검출할 수 있는 장점이 있으며, 운동 성능을 평가하는 기존 행동 검사에 비해 우수합니다.
Abstract
갑상선 호르몬(TH) 작용은 소뇌를 포함한 중추 신경계의 발달 과정에서 필수적입니다. 선천성 갑상선 기능 저하증과 같은 어린 시절에 TH 결핍이 있는 경우, 환자는 인지 지연 및 운동 장애와 같은 신경학적 장애를 보입니다. 소뇌에서 TH의 역할을 조사하기 위해 조직 또는 세포 특이적 TH 결핍이 있는 마우스 모델을 사용하는 다양한 연구가 있습니다. 일반화된 선천성 갑상선 기능 저하증 마우스와 비교했을 때, 소뇌 세포 특이적 TH 결핍 마우스는 더 경미하고 미묘한 운동 실태 특징을 나타내기 때문에 rotarod 테스트와 같은 기존 테스트를 사용할 때 운동 기능 평가가 어렵습니다.
TH 관련 동물 모델에서 운동 기능을 평가하기 위한 대체 도구가 필요했기 때문에 모델 마우스의 운동 실조증 중증도에 따라 다양한 사다리 테스트를 설계할 수 있는 “사다리 빔 테스트”라는 다양한 행동 방법을 개발했습니다. 우리는 소뇌 피질의 유일한 출력 뉴런인 소뇌 Purkinje 세포에서 우성-음성 TH 수용체를 특이적으로 발현하는 형질전환 마우스를 활용했습니다. 새로 구축된 래더 빔 테스트는 로타로드 테스트에 비해 더 높은 수준에서 형질전환 마우스의 강력한 운동 성능 장애를 성공적으로 감지했습니다. 운동 학습의 중단은 사다리 빔 테스트에서도 감지되었지만 rotarod 테스트에서는 감지되지 않았습니다. 이 새로운 행동 장치를 사용한 프로토콜은 소뇌 기능의 미묘한 변화를 조사하기 위해 경미한 무산소 표현형을 보일 수 있는 다른 동물 모델에 적용할 수 있습니다.
Introduction
갑상선 호르몬(TH)은 뇌 발달에 없어서는 안 될 존재1. 특히, 소뇌에서의 역할은 매우 중요한데, 그 이유는 어린 시절의 TH 결핍이 비정상적인 소뇌 발달을 유발하기 때문이다 1,2. 예를 들어, 선천성 갑상선 기능 저하증에서 환자는 인지 및 운동 장애를 포함한 일련의 신경학적 지체를 보인다3. 소뇌 기능 발달에서 TH의 역할을 밝히기 위해 일부 연구에서는 소뇌 세포 특이적 방식으로 TH 결핍을 제한했습니다4. 그러나 모든 조직과 세포가 TH 결핍의 영향을 받는 일반화된 선천성 갑상선 기능 저하증 마우스와 비교했을 때, 이러한 소뇌 특이적 모델은 매우 미묘한 운동 실조를 나타내기 때문에 rotarod, footprint 및 balance beam 테스트와 같은 기존 행동 테스트로는 차이를 거의 감지하지 못합니다. 따라서 소뇌 기능에 대한 TH 효과를 완전히 조사하려면 모델 마우스의 운동 조정에서 미묘한 변화를 감지하기 위한 새로운 평가 도구가 필요합니다.
로타로드 테스트는 운동 협응을 평가하기 위한 가장 일반적인 도구로, 원래 Dunham과 Miya5 에 의해 개발되었으며 나중에 Jones와 Roberts6에 의해 가속 버전에 적용되었습니다. 회전하는 막대에서 떨어지는 잠복기는 운동 협응력을 테스트하는 것으로 해석되며, 그 단순성과 간결성으로 인해 운동 기능을 연구하는 행동 연구자들 사이에서 일반적으로 사용됩니다7. 그러나 이 테스트의 사용 편의성은 양날의 검입니다. 막대가 자동으로 회전하기 때문에 쥐는 움직이지 않고 회전하는 막대에 달라붙어 머물 수 있습니다. 더욱이, 쥐는 회전하는 막대 위에서 균형을 유지하기보다는 떨어지려고 할 수 있습니다. 두 경우 모두 “순수 운동 협응력”을 평가하기 위해 테스트의 유효성과 신뢰성이 의심됩니다.7. 즉, 소뇌 기능을 정확하게 표적으로 삼지 않고 그립을 위한 근력과 같은 다른 요인을 포함합니다.
운동 협응력 평가를 위한 기존의 도구 대신, 여기에서는 최근에 우리 실험실에서 개발된 “래더 빔 테스트”라는 새로운 행동 테스트를 제시합니다. 수평 사다리 보행 검사는 소뇌 관련 복합 운동 능력을 평가하기 위해 고안되었습니다: 피드포워드 예측 및 움직임의 적분8. 테스트 장치는 구멍이 있는 4개의 플렉시 유리로 구성되었습니다 (그림 1). 4 개의 플레이트는 플레이트의 구멍에 삽입 된 나사와 막대기로 병렬로 연결되었습니다. 장치를 안정화하기 위해 두 개의 외부 플레이트가 사용되었고 두 개의 내부 플레이트가 다양한 종류의 사다리 가로대를 설계하는 데 사용되었습니다 (그림 2C). 가로대의 너비는 동물의 크기에 따라 조정되어 동물이 뒤로 이동하는 것을 최소화했습니다 (그림 2B). 출발 지점에서 골대까지의 거리는 110cm였습니다. 장치는 벤치에서 60cm 위에 위치했으며 장치 아래에 안전 쿠션이 설치되었습니다 (그림 2A). 동물들이 목표를 향해 움직이도록 동기를 부여하기 위해 어두운 방을 목표 근처에 배치했습니다 (그림 2A).
소뇌 Purkinje 세포(Mf-1/FVB 마우스)에서 우성-음성 TH 수용체(TR)를 발현하는 형질전환 마우스를 사용하여 소뇌 기능 발달에 대한 TH 효과를 조사했습니다. rotarod 및 ladder beam 테스트 모두에서 Mf-1 / FVB 마우스에서 소뇌 운동 실태 표현형을 관찰했습니다. 그러나 래더 빔 테스트는 Rotarod 테스트보다 더 중요한 차이를 감지하는 데 성공했습니다(그림 3). 또한 사다리 빔 테스트에서 운동 학습 능력을 보다 철저하게 평가할 수 있습니다(그림 3B,C). 이러한 행동 표현형의 세포 배경으로서, 장기 우울증(LTD)의 유도를 억제하고, 대신에 Mf-1/FVB Purkinje 세포에서 LTD-유도 자극에 따라 장기 강화(LTP)를 유도하였다9. LTD는 소뇌의 운동 협응력과 운동 학습에 필수적이다10. 많은 연구에서 소뇌 기능의 주요 조절 유전자에 대한 녹아웃 또는 돌연변이 마우스에서 운동 결핍 및 LTD의 억제를 보고했지만, LTD 유도 자극 후 LTP의 유도를 보고한 연구는 없습니다11,12. 종합하면, 이 현상은 Mf-1/FVB 마우스 또는 TH 결핍 마우스에서 고유할 수 있으며(성인 발병 갑상선 기능 저하증 마우스에서도 동일한 현상이 관찰됨), TH가 다른 주요 단백질과 다르게 소뇌 기능을 조절한다는 것을 시사합니다. 만약 그렇다면, 비정상적인 TH 작용을 가진 마우스는 다른 모델 마우스와 같은 방식으로 소뇌 운동 실조증을 나타내지 않는 것이 타당하다. 이것은 소뇌 기능에 대한 TH 효과를 평가하기 위한 특정 방법의 필요성을 다시 강조합니다. 이 논문은 새로 구축된 사다리 빔 테스트를 사용하여 소뇌 기능에 대한 TH 효과를 조사하기 위한 새로운 프로토콜을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 디자인은 “사다리 가로대 보행 테스트”13,14의 유용성을 보고한 Metz와 Whishaw의 과거 연구를 기반으로 했습니다. 그들은 숙련된 보행을 평가하고 동물이 수평 사다리13,14에서 시작 지점에서 목표까지 걷도록 요구함으로써 앞다리와 뒷다리의 배치, 걸음걸이 및 사지 간 협응력을 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본과학진흥회(Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI)의 지원을 받았습니다(N.K.는 18H03379, I.A.는 21K15340, A.N.은 22J11280).
Materials
| Air puff | DAISO | ||
| Aluminum sticks | CAINZ | 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval). | |
| Blutack | Bostik | ||
| Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each | |
| Screws | CAINZ |
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