מבחן Active Place Avoidance (APA), משימת למידה מרחבית יעילה, רב-תכליתית וחוזרת על עצמה עבור עכברים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול למבחן הימנעות ממקום פעיל, פרדיגמת למידה מרחבית תלוית היפוקמפוס המיועדת למכרסמים. שינוי פרמטרים מרכזיים מאפשר בדיקה חוזרת של בעלי חיים לפני ואחרי טיפולים או לאורך זמן.
Abstract
למידה מרחבית תלוית היפוקמפוס במכרסמים נבדקה במגוון שיטות. אלה כוללים את מבוך המים מוריס (MWM), מבוך Y, ומשימות מיקום אובייקטים חדשות (NOL). לאחרונה, משימת הימנעות המקום הפעיל (APA) פותחה כחלופה לגישות מסורתיות יותר אלה. במשימת APA, עכברים חייבים להשתמש ברמזים מרחביים הממוקמים סביב זירה מסתובבת כדי להימנע מאזור הלם נייח. בשל הפרמטרים המרובים שניתן לכוונן, משימת APA הוכחה כגישה רב-תכליתית מאוד. הוא מתאים לשימוש אורכי וחוזר ונשנה עבור אותה קבוצת עכברים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע מוצלח של משימת APA. אנו גם מדגישים גישות APA חלופיות שניתן להשתמש בהן כדי לבחון מרכיבים שונים של למידה מרחבית. אנו מתארים את תהליכי איסוף הנתונים וניתוחם. צעדים קריטיים במהלך משימת APA נדונים כדי להגדיל את הסבירות לביצוע מוצלח של הבדיקה. למשימת APA מספר יתרונות על פני מבחני ניווט מרחביים מסורתיים יותר. זה מתאים לשימוש עם עכברים קשישים או אלה עם פנוטיפים של מחלות כגון מחלת אלצהיימר. ניתן לשנות בקלות את מורכבות המשימה, ולאפשר לבחון מגוון רחב של זני עכברים. יתר על כן, משימת APA מתאימה לבדיקת בעלי חיים שעברו ניתוח או התערבויות ניסיוניות שעשויות להשפיע על תפקוד מוטורי או עצבי, כגון שבץ או פגיעה מוחית טראומטית.
Introduction
הימנעות ממקום פעיל (APA) היא כלי יעיל לבדיקת למידה מרחבית תלוית היפוקמפוס במכרסמים 1,2,3,4. במהלך משימת APA, בעל החיים ממוקם על זירה מסתובבת ונדרש להשתמש ברמזים חזותיים כדי להתמצא ולהימנע מאזור הלם מרתיע5. סיבוב הזירה מבטיח כי העכבר אינו מסוגל להשתמש בגישה אידיוטית לניווט, וגם לא ניתן להשתמש בסימני ריח, שכן רמזים אלה מסתובבים על הפלטפורמה בעוד אזור הזעזוע נשאר נייח5. שינוי המהירות והכיוון של הזירה, כמו גם מיקום אזור ההלם והרמזים החזותיים, מאפשר בדיקה חוזרת של עכברים מספר פעמים 6,7,8. ה- APA מציע מספר יתרונות ברורים בהשוואה למבוך המים מוריס (MWM), אחד ממבחני הלמידה המרחבית הנפוצים ביותר. חשוב לציין, לעכברים יש סלידה משחייה והם מוצאים את משימת MWM מלחיצה מאוד9. יתר על כן, דווח כי עכברים זקנים צפים במהלך משימת MWM10, מה שהופך אותה ללא מתאימה כמטלת למידה מרחבית במקרים רבים. יתר על כן, מכיוון שמשימת MWM דורשת פלטפורמה נסתרת ושקועה עבור העכברים לאתר במהלך הבדיקה. זה מחייב את המים להיות אטומים, אשר מושגת בדרך כלל על ידי תוספת של צבע לבן. מעקב וניתוח של בעלי חיים במהלך משימות התנהגותיות דורש ניגודיות מספקת בין הנושא לסביבתו, למעט זני עכברים מסוימים כגון Swiss או BALB/c מלהיבדק ב- MWM. במשימת APA, בעיה זו נעקפת באמצעות תוספת של פלסטיק שחור מתחת לרשת.
פרדיגמות APA מרובות תוכננו לבחון למידה מרחבית, תוך הדגמת התועלת שלה ככלי התנהגותי יעיל. לדוגמה, רכישה, שימור וגיבוש של למידה מרחבית מושגת בדרך כלל על ידי ניסויים יומיים בבעלי חיים שיכולים לנוע בין 3-5 ימים 6,7,11,12. זיכרון ולמידה מכומתים על ידי השוואת מספר הזעזועים המתקבלים בכל יום רכישה. זמן הכניסה הראשונה והזמן המרבי הימנעות מאזור ההלם הם גם פרמטרים חשובים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע שינויים ביכולת הלמידה במהלך המשימה. לחלופין, ניתן לבדוק זיכרון עבודה מרחבי על ידי ביצוע מפגש APA יחיד בן 30 דקות 2,13 שבו למידה מרחבית נמדדת כשינויים בתוך הפגישה על ידי השוואת ביצועים, כגון מספר הלם, בפחים של 5 דקות.
במאמר זה, אנו מתארים את משימת APA ומדגישים את התכונות העיקריות שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע מבחן למידה מרחבית זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לסיכום, מבחן הימנעות ממקום פעיל הוא מטלת למידה מרחבית יעילה שניתן להשתמש בה במגוון זני עכברים ובתנאי ניסוי. משימת APA מתגברת על מגבלות הקשורות לפרדיגמות למידה מרחביתאחרות 14, כגון MWM, שהוא מלחיץ עבור העכברים כפי שנמדד על ידי רמות קורטיזול9. ה-MWM גם אינו מתאים לעכברים זקנים, שם דווח שהם צפים במהלך משימה10. אף על פי שמבחני למידה מרחבית אחרים, כגון מבוך בארנס ומבחן מיקום עצמים חדשני, הם פחות מלחיצים, הם מוגבלים על ידי התדירות שבה ניתן לבצע בדיקות חוזרות על אותה קבוצת עכברים. לכן, היתרון העיקרי של משימת APA הוא שניתן להשתמש בה מספר פעמים מכיוון שניתן להתאים מספר פרמטרים כדי לשמור על חידוש. ואכן, השתמשנו במטלת APA עד 5 פעמים על אותה קבוצת עכברים כדי לבחון את ההשפעה של אבלציה בהיפוקמפוס ואת ההשפעה של תרגיל8 לאחר מכן. בכל אחד מהמקרים, הפרמטרים, כולל סיבוב הזירה, אזור ההלם והרמזים המרחביים, שונו בין המבחנים. זה היה יעיל להבטיח שהעכברים השתמשו ברמזי ניווט מרחביים כדי ללמוד מחדש את המשימה, כפי שמעידים חיות הביקורת, שהתחילו עם מספר גבוה של זעזועים ואז פחתו במהלך ימי הניסוי הבאים עבור כל תקופת ניסוי8. בדרך כלל, בסוף פרדיגמת בדיקה של 5 ימים, אנו לוקחים בחשבון שכל בעל חיים שקיבל יותר מ -10 מכות חשמל ביום האחרון או שיש לו הימנעות מקסימלית של פחות מ -60 שניות לא למד את הפרדיגמה.
מעבר ליכולת לשנות הגדרות בקלות כדי לאפשר סבבים מרובים של בדיקות מרחביות, משימת APA מבטיחה שעכברים חייבים להשתמש בניווט מרחבי כדי להימנע ביעילות מאזור ההלם. לדוגמה, בעלי חיים חייבים להשתמש ברמזים חיצוניים כדי לאתר ולהימנע מכניסה לאזור ההלם הנייח על ידי ניווט הרחק ממנו5. כאשר הזירה מסתובבת, בעלי חיים אינם מסוגלים להשתמש בגישה אידיוטית לניווט, והם גם אינם יכולים להשתמש ברמזים חיצוניים כגון ריח, מכיוון שרמזים אלה מסתובבים עם הזירה בעוד אזור ההלם והרמזים המרחביים נשארים נייחים5.
חשוב גם לוודא שהעכברים מורגלים כראוי לזירת החוקר וה-APA. גם עוצמת הזעזועים בכף הרגל צריכה להיות אופטימלית, מכיוון שגם עוצמת זעזועים נמוכה מדי וגם עוצמת זעזועים גבוהה מדי עלולות לפגוע ביכולתם של עכברים ללמוד ולבצע את המשימה5. עוצמת הזעזוע מוגדרת בדרך כלל ל- 0.5 mA ולא תעלה על 0.7 mA. עבור בעלי חיים שיש להם התנהגות מוגברת דמוית חרדה, שקול להפחית הן את עוצמת האור והן את עוצמת הזעזועים ברגל. חרדה מוגברת במהלך משימת APA יכולה להתבטא בקפיצות יתר, ריצה בלתי מבוקרת בתוך הזירה, או קיפאון ממושך. הפרוטוקול המתואר כאן השתמש בעוצמת הלם של 0.5 mA, אותה עוצמה שבה נעשה שימוש בעבר עם BALB/c, אשר ידוע כבעל התנהגות דמוית חרדה גבוהה יותר15.
כאן, אנו מתארים את תוכנת מעקב בעלי החיים שסופקה על ידי החברה שסיפקה את מתקן מניעת המקום הפעיל בשימוש. תוכנת מעקב וידאו חלופית מתאימה גם לניתוח ביצועים התנהגותיים. תוכניות אלה יכולות גם למדוד ולנתח במדויק את ביצועי העכבר במהלך משימות APA. תוכניות אלה מאפשרות ליצור מספר אזורים ומיקומים בתוך זירת APA כדי להעריך התנהגות. הגדרת הזירה עבור APA מורכבת מאזור הלם משולש אחד, שבו נמדדים מספר הכניסות, זמן הכניסה הראשונה והזמן המושקע באזור ההלם. ניתן להוסיף גם אזורים נוספים בתוך הזירה. לדוגמה, אנו יכולים להוסיף אזור מרכזי או אזור מול אזור ההלם כדי למדוד את הזמן המושקע, ואת המרחק שעבר באזורים אלה כאסטרטגיה של בעלי חיים כדי להימנע מהאזור המרתיע. תוכניות אלה עוקבות אחר מרכז המסה של העכבר, אשר נשמר לאחר מכן ומוצג מעל מסגרת הייחוס לבדיקה חזותית (איור 6A,B). לבסוף, אפשר גם ליצור מפת חום של צפיפות עבור ביצועים אישיים וקבוצתיים (איור 6C).
בעת ביצוע משימת APA, ישנם נושאים פוטנציאליים שיש לטפל בהם. לעיתים, יהיה צורך להוציא עכברים מהניתוח עקב אי היענות לאזור ההלם. כמו תמיד, יש לשקול החרגה רק כאשר הם עומדים בתנאים חריגים מוגדרים מראש, למשל, נופלים מחוץ ל-2 סטיות תקן מהממוצע. משימות התנהגותיות מורכבות כגון APA דורשות בדרך כלל ערכי N גבוהים של בעלי חיים. אנו מציעים לבצע ניתוח הספק כדי לחשב את גודל המדגם המתאים לפני ביצוע APA. זה יהיה תלוי בזן בשימוש ובקבוצות הטיפול. מניסיון, אנו מוצאים כי ערך n של 10 או יותר עבור כל קבוצה מספק מספיק כוח בעת ביצוע ניסויים APA. הבעיה העיקרית עם משימה זו היא הבטחת מעקב באיכות גבוהה של העכבר במהלך המשימה. יש להשתמש בשלב ההרגלה של המשימה כדי לאשר שזה קורה. עכברים שאינם מגיבים להלם חשמלי נובעים לעתים קרובות מסרגלי הרשת. לכן, חיוני לנקות את האסדה אחרי כל בעל חיים ולהסיר כל שתן או שתן. זה גם יפחית את הלחץ עבור בעלי החיים הבאים. משימת APA כוללת בדרך כלל פרדיגמה של 5 ימים, אשר עשויה להציג מגבלות מסוימות עבור מחקרים הכוללים התערבויות יעילות פחות מ -5 ימים; עם זאת, זיכרון לטווח קצר או רכישת למידה מרחבית עדיין ניתן להעריך עבור מחקרים כאלה באמצעות גישה של 30 דקות, מפגש יחיד.
לסיכום, מאמר זה מספק תיאור מפורט של האופן שבו ניתן להגדיר ולהשתמש בפרדיגמת הימנעות המקום הפעיל כדי לבחון את הלמידה המרחבית של עכברים. היכולת לשנות תנאים כך שניתן יהיה לבחון זני עכברים מרובים בצבעים שונים היא יתרון מובהק על פני בדיקות מרחביות מסורתיות יותר, כגון MWM. יתר על כן, שינוי של פרמטרים מרובים מאפשר בדיקות חוזרות, כך שניתן להשוות במדויק את השינויים בלמידה מרחבית במהלך פרדיגמות ניסוייות שונות או במהלך הזדקנות פיזיולוגית. בפרק זמן קצר, מבחן APA הוכח כחלופה מדויקת ויעילה ללמידה מרחבית תלוית היפוקמפוס. בעתיד, משימת APA יכולה לשמש כשיטה אמינה להערכת התערבויות טיפוליות או גופניות על התנהגות קוגניטיבית ומרחבית הן בעכברי בר והן בעכברים טרנסגניים.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן התנהגות בעלי החיים של מכון המוח של קווינסלנד (QBI) על הפיתוח והתחזוקה של המנגנון המתואר בכתב יד זה.
Materials
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
Referenzen
- Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).
- Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice. Front Behav Neurosci. 11, 197 (2017).
- Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice. STAR Protoc. 3 (3), 101500 (2022).
- Pastalkova, E., et al. Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP. Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).
- Stuchlik, A., et al. Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory. Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).
- Vukovic, J., et al. Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering. J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).
- Blackmore, D. G., et al. An exercise "sweet spot" reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis. iScience. 24 (11), 103275 (2021).
- Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis. Sci Rep. 10 (1), 19269 (2020).
- Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).
- van Praag, H., Shubert, T., Zhao, C., Gage, F. H. Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice. J Neurosci. 25 (38), 8680-8685 (2005).
- Zhou, X. A., et al. Neurogenic-dependent changes in hippocampal circuitry underlie the procognitive effect of exercise in aging mice. iScience. 24 (12), 103450 (2021).
- Leinenga, G., Gotz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 278ra33 (2015).
- Willis, E. F., et al. Repopulating microglia promote brain repair in an IL-6-dependent manner. Cell. 180 (5), 833-846 (2020).
- Lesburgueres, E., Sparks, F. T., O’Reilly, K. C., Fenton, A. A. Active place avoidance is no more stressful than unreinforced exploration of a familiar environment. Hippocampus. 26 (12), 1481-1485 (2016).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
