Der Active Place Avoidance (APA) Test, eine effektive, vielseitige und wiederholbare räumliche Lernaufgabe für Mäuse
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für den aktiven Ortsvermeidungstest vor, ein Hippocampus-abhängiges räumliches Lernparadigma, das für Nagetiere entwickelt wurde. Die Änderung wichtiger Parameter ermöglicht es, Tiere vor und nach der Behandlung oder im Laufe der Zeit erneut zu testen.
Abstract
Das Hippocampus-abhängige räumliche Lernen bei Nagetieren wurde mit einer Vielzahl von Methoden getestet. Dazu gehören das Morris-Wasserlabyrinth (MWM), das Y-Labyrinth und die NOL-Aufgaben (Novel Object Location). In jüngerer Zeit wurde die aktive Ortsvermeidung (APA) als Alternative zu diesen traditionelleren Ansätzen entwickelt. In der APA-Aufgabe müssen Mäuse räumliche Hinweise verwenden, die um eine rotierende Arena herum platziert sind, um eine stationäre Schockzone zu vermeiden. Aufgrund der vielfältigen Parameter, die angepasst werden können, hat sich gezeigt, dass die APA-Aufgabe ein sehr vielseitiger Ansatz ist. Es eignet sich für die Verwendung im Längsschnitt und wiederholt für dieselbe Kohorte von Mäusen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die APA-Aufgabe erfolgreich durchzuführen. Wir beleuchten auch alternative APA-Ansätze, mit denen verschiedene Komponenten des räumlichen Lernens untersucht werden können. Wir beschreiben die Prozesse der Datenerhebung und -analyse. Kritische Schritte während der APA-Aufgabe werden besprochen, um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Durchführung des Tests zu erhöhen. Die APA-Aufgabe hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Tests der räumlichen Navigation. Es ist geeignet für die Anwendung bei gealterten Mäusen oder Mäusen mit Krankheitsphänotypen wie der Alzheimer-Krankheit. Die Komplexität der Aufgabe kann leicht verändert werden, so dass eine breite Palette von Mausstämmen getestet werden kann. Darüber hinaus eignet sich die APA-Aufgabe für die Untersuchung von Tieren, die sich einer Operation oder experimentellen Eingriffen unterzogen haben, die die motorische oder neuronale Funktion beeinträchtigt haben könnten, wie z. B. Schlaganfall oder traumatische Hirnverletzung.
Introduction
Die aktive Ortsvermeidung (APA) ist ein wirksames Instrument, um das Hippocampus-abhängige räumliche Lernen bei Nagetieren zu testen 1,2,3,4. Während der APA-Aufgabe wird das Tier auf eine rotierende Arena gesetzt und muss visuelle Hinweise verwenden, um sich zu orientieren und eine aversive Schockzone5 zu vermeiden. Die Drehung der Arena stellt sicher, dass die Maus weder einen idiothetischen Ansatz für die Navigation verwenden kann, noch können Duftmarken verwendet werden, da sich diese Hinweise auf der Plattform drehen, während die Schockzone stationär bleibt5. Die Änderung der Geschwindigkeit und Richtung der Arena sowie der Position der Schockzone und der visuellen Hinweise ermöglicht es, Mäuse mehrmals zu testen 6,7,8. Der APA bietet mehrere deutliche Vorteile im Vergleich zum Morris-Wasserlabyrinth (MWM), einem der am weitesten verbreiteten räumlichen Lerntests. Wichtig ist, dass Mäuse eine Abneigung gegen das Schwimmen haben und die MWM-Aufgabe als extrem stressig empfinden9. Darüber hinaus wurde berichtet, dass gealterte Mäuse während der MWM-Aufgabe10 schweben, was sie in vielen Fällen als räumliche Lernaufgabe ungeeignet macht. Darüber hinaus erfordert die MWM-Aufgabe eine versteckte, untergetauchte Plattform, die die Mäuse während des Tests lokalisieren können. Dies erfordert, dass das Wasser undurchsichtig ist, was typischerweise durch die Zugabe von weißer Farbe erreicht wird. Die Verfolgung und Analyse von Tieren während verhaltensbezogener Aufgaben erfordert einen ausreichenden Kontrast zwischen Probanden und Umgebung, wobei bestimmte Mausstämme wie Swiss oder BALB/c von der Prüfung im MWM ausgeschlossen werden. In der APA-Aufgabe wird dieses Problem durch die Zugabe von schwarzem Kunststoff unter dem Gitter umgangen.
Mehrere APA-Paradigmen wurden entwickelt, um räumliches Lernen zu testen und seine Nützlichkeit als effektives Verhaltenswerkzeug zu demonstrieren. Zum Beispiel wird der Erwerb, die Beibehaltung und die Konsolidierung des räumlichen Lernens typischerweise durch tägliche Tests an Tieren erreicht, die zwischen 3 und 5 Tagen liegen können 6,7,11,12. Gedächtnis und Lernen werden quantifiziert, indem die Anzahl der an jedem Erfassungstag erhaltenen Schocks verglichen wird. Die Zeit bis zum ersten Eintritt und die maximale Zeit, in der die Schockzone umgangen wird, sind ebenfalls wichtige Parameter, anhand derer Veränderungen der Lernfähigkeit während der Aufgabe festgestellt werden können. Alternativ kann das räumliche Arbeitsgedächtnis getestet werden, indem eine einzelne 30-minütige APA-Sitzung 2,13 durchgeführt wird, in der das räumliche Lernen gemessen wird, da sich die Leistung innerhalb der Sitzung ändert, indem die Leistung, wie z. B. die Schockzahl, in 5-Minuten-Bins verglichen wird.
In diesem Artikel beschreiben wir die APA-Aufgabe und heben die wichtigsten Merkmale hervor, die bei der Durchführung dieses räumlichen Lerntests berücksichtigt werden müssen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der aktive Ortsvermeidungstest eine effektive räumliche Lernaufgabe ist, die auf einer Vielzahl von Mausstämmen und experimentellen Bedingungen angewendet werden kann. Die APA-Aufgabe überwindet Einschränkungen, die mit anderen räumlichen Lernparadigmenverbunden sind 14, wie z. B. dem MWM, das für die Mäuse stressig ist und anhand des Cortisolspiegelsgemessen wird 9. Das MWM ist auch ungeeignet für gealterte Mäuse, bei denen berichtet wurde, dass sie während der Aufgabeschweben 10. Obwohl andere räumliche Lerntests, wie das Barnes-Labyrinth und der neuartige Objektortungstest, weniger stressig sind, sind sie dadurch begrenzt, wie oft Wiederholungstests an derselben Kohorte von Mäusen durchgeführt werden können. Daher besteht der Hauptvorteil der APA-Aufgabe darin, dass sie mehrfach verwendet werden kann, da mehrere Parameter angepasst werden können, um die Neuheit zu erhalten. In der Tat haben wir die APA-Aufgabe bis zu 5 Mal an derselben Kohorte von Mäusen verwendet, um die Wirkung der Hippocampus-Ablation und die anschließende Wirkung von Übungzu untersuchen 8. In jedem Fall wurden die Parameter, einschließlich der Arenadrehung, der Schockzone und der räumlichen Hinweise, zwischen den Tests geändert. Dies stellte sicher, dass die Mäuse räumliche Navigationshinweise verwendeten, um die Aufgabe neu zu erlernen, wie von den Kontrolltieren gezeigt, beginnend mit einer hohen Anzahl von Schocks und dann abnehmend während der nachfolgenden Testtage für jeden Testzeitraum8. In der Regel gehen wir am Ende eines 5-Tage-Testparadigmas davon aus, dass jedes Tier, das am letzten Tag mehr als 10 Schocks erhalten hat oder eine maximale Vermeidung von weniger als 60 s aufweist, das Paradigma nicht gelernt hat.
Neben der Möglichkeit, Einstellungen einfach zu ändern, um mehrere Runden räumlicher Tests zu ermöglichen, stellt die APA-Aufgabe sicher, dass Mäuse die räumliche Navigation verwenden müssen, um die Schockzone effektiv zu vermeiden. Zum Beispiel müssen Tiere externe Signale verwenden, um die stationäre Schockzone zu lokalisieren und zu vermeiden, indem sie sich von ihr weg bewegen5. Da sich die Arena dreht, sind Tiere nicht in der Lage, einen idiothetischen Ansatz für die Navigation zu verwenden, noch können sie exterozeptive Signale wie Gerüche verwenden, da sich diese Signale mit der Arena drehen, während die Schockzone und die räumlichen Signale stationär bleiben5.
Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass Mäuse angemessen an den Forscher- und APA-Bereich gewöhnt sind. Die Intensität des Fußschocks muss ebenfalls optimiert werden, da sowohl eine zu niedrige als auch eine zu hohe Schockintensität die Lernfähigkeit der Mäuse beeinträchtigen können, zu lernen und die Aufgabeauszuführen 5. Die Schockintensität ist in der Regel auf 0,5 mA eingestellt und sollte 0,7 mA nicht überschreiten. Bei Tieren, die verstärktes angstähnliches Verhalten aufweisen, sollten Sie in Betracht ziehen, sowohl die Lichtintensität als auch die Intensität des Fußschocks zu reduzieren. Erhöhte Angst während der APA-Aufgabe kann sich entweder in übermäßigem Springen, unkontrolliertem Laufen innerhalb der Arena oder längerem Einfrieren äußern. Das hier beschriebene Protokoll verwendete eine Schockintensität von 0,5 mA, die gleiche Intensität, die zuvor bei BALB/c verwendet wurde, von der bekannt ist, dass sie ein höheres angstähnliches Verhalten aufweist15.
Hier beschreiben wir die Tierverfolgungssoftware, die von dem Unternehmen bereitgestellt wurde, das das verwendete aktive Ortsvermeidungsgerät bereitgestellt hat. Alternative Video-Tracking-Software eignet sich auch für die Analyse der Verhaltensleistung. Diese Programme können auch die Leistung der Maus während APA-Aufgaben genau messen und analysieren. Diese Programme ermöglichen die Schaffung mehrerer Zonen und Orte innerhalb der APA-Arena, um das Verhalten zu bewerten. Die Arena-Umgebung für eine APA besteht aus einer dreieckigen Schockzone, in der die Anzahl der Eingänge, die Zeit bis zum ersten Betreten und die in der Schockzone verbrachte Zeit gemessen werden. Innerhalb der Arena können auch zusätzliche Zonen hinzugefügt werden. Zum Beispiel können wir eine zentrale Zone oder eine Zone gegenüber der Schockzone hinzufügen, um die verbrachte Zeit und die in diesen Zonen zurückgelegte Strecke als Tierstrategie zu messen, um die aversive Zone zu vermeiden. Diese Programme verfolgen den Massenschwerpunkt der Maus, der dann gespeichert und zur visuellen Inspektion über dem Referenzrahmen angezeigt wird (Abbildung 6A,B). Schließlich ist es auch möglich, eine Dichte-Heatmap für die Leistung von Einzelpersonen und Gruppen zu erstellen (Abbildung 6C).
Bei der Durchführung der APA-Aufgabe gibt es potenzielle Probleme, die angegangen werden müssen. Gelegentlich müssen Mäuse von der Analyse ausgeschlossen werden, weil sie nicht auf die Schockzone reagieren. Wie immer sollte ein Ausschluss nur in Betracht gezogen werden, wenn sie vordefinierte Ausreißerbedingungen erfüllen, z. B. wenn sie außerhalb von 2 Standardabweichungen vom Mittelwert liegen. Komplexe Verhaltensaufgaben wie die APA erfordern typischerweise hohe N-Werte von Tieren. Wir empfehlen, vor der APA eine Power-Analyse durchzuführen, um die geeignete Stichprobengröße zu berechnen. Dies hängt vom verwendeten Stamm und den Behandlungsgruppen ab. Aus Erfahrung stellen wir fest, dass ein n-Wert von 10 oder mehr für jede Gruppe bei der Durchführung von APA-Experimenten eine ausreichende Leistung liefert. Das Hauptproblem bei dieser Aufgabe besteht darin, eine qualitativ hochwertige Verfolgung der Maus während der Aufgabe sicherzustellen. Die Gewöhnungsphase der Aufgabe sollte verwendet werden, um zu bestätigen, dass dies geschieht. Mäuse, die nicht auf einen Schock reagieren, sind oft auf Kot zwischen den Gitterstäben zurückzuführen. Es ist daher wichtig, das Rig nach jedem Tier zu reinigen und Kot oder Urin zu entfernen. Dadurch wird auch der Stress für die nachfolgenden Tiere reduziert. Die APA-Aufgabe beinhaltet in der Regel ein 5-Tage-Paradigma, was für Studien mit Interventionen, die weniger als 5 Tage wirksam sind, einige Einschränkungen mit sich bringen kann; Das Kurzzeitgedächtnis oder der räumliche Lernerwerb können jedoch weiterhin für solche Studien mit dem 30-minütigen Ansatz in einer Sitzung bewertet werden.
Zusammenfassend bietet dieser Artikel eine detaillierte Beschreibung, wie das aktive Ortsvermeidungsparadigma eingerichtet und verwendet werden kann, um das räumliche Lernen von Mäusen zu testen. Die Möglichkeit, die Bedingungen so zu ändern, dass mehrere Mausstämme unterschiedlicher Farbe getestet werden können, ist ein deutlicher Vorteil gegenüber anderen, traditionelleren räumlichen Tests wie dem MWM. Darüber hinaus ermöglicht die Modifikation mehrerer Parameter wiederholte Tests, so dass die Veränderungen des räumlichen Lernens während verschiedener experimenteller Paradigmen oder während des physiologischen Alterns genau verglichen werden können. In kurzer Zeit hat sich der APA-Test als genaue und effektive Alternative zum Hippocampus-abhängigen räumlichen Lernen erwiesen. In Zukunft kann die APA-Aufgabe als zuverlässige Methode zur Bewertung von therapeutischen oder körperlichen Interventionen auf kognitives und räumliches Verhalten sowohl bei Wildtyp- als auch bei transgenen Mäusen verwendet werden.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Animal Behaviour Facility des Queensland Brain Institute (QBI) für die Entwicklung und Wartung des in diesem Manuskript beschriebenen Geräts.
Materials
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
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