중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

모든 프로토콜은 동물 복지에 대한 기관 및 국가 지침과 규정을 준수하여 수행되었습니다. 1. 시약 준비 참고: 이 연구에 사용된 시약의 원료 및 최종 농도는 표 1에 나와 있습니다. 시료 채취 완충액 준비: 페니실린(100U/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 겐타마이신(25μg/mL) 및 카스포풍긴(2.5μg/mL)을 함유한 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS) 1L를 혼합합니다. 원액을 4 °C에서 보관하십시오. 해리 시약 #1 준비: 18.55mL의 샘플 수집 완충액(1.1단계에서 설명됨), 1.422mL의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 0.422M/pH 7.4), 1M 1,4-디티오트레이톨(DTT) 용액 20μL, Y-27632 용액 4μL(5000x/50mM)를 혼합합니다. 용액을 4°C에서 보관합니다. 해리 시약 #2 준비: 18.57mL의 수집 완충액(1.1단계에서 설명됨), 1.422mL의 EDTA(0.422M/pH 7.4), 4μL의 Y-27632 용액(5000x/50mM)을 혼합합니다. 용액을 37°C에서 보관합니다. 장내 성장 배지 스톡 준비: 오가노이드 성장 배지 9.875mL와 보충제, 페니실린 100μL(100U/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 겐타마이신 5μL(25μg/mL) 및 카스포푼진 20μL(2.5μg/mL)를 혼합합니다. 용액을 4°C에서 보관합니다. 장내 분화 배지 스톡 준비: 오가노이드 분화 배지 10mL와 보충제, 페니실린 100μL(100U/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 겐타마이신 5μL(25μg/mL) 및 카스포푼진 20μL(2.5μg/mL)를 혼합합니다. 용액을 -20 °C에서 보관하십시오. 세척 배지 준비: DMEM/F-12 1.1 배지 48.45mL(L-글루타민 포함, HEPES 제외), 비타민 A 미함유 B-27 보충제 1mL(50x 스톡), 페니실린 500μL(100U/mL), 스트렙토마이신(100μg/mL), 겐타마이신 25μL(50mg/mL 스톡), 카스포푼진 25μL(5mg/mL 스톡)를 혼합합니다. 용액을 4°C에서 보관합니다. 코팅 완충액 준비: 억제제가 없는 DMEM: F12 complete 배지 25mL와 소 혈청 알부민(BSA) 25mg을 혼합합니다. 용액을 4°C에서 보관합니다. 2. 전체 조직에서 장낭 분리(그림 1) 참고: 소 소장 장내염은 현지 소고기 가공 공장에서 생산된 건강한 성인 홀스타인 수송아지(>2세)에서 얻은 회장 조직에서 생성되었습니다. 이 일련의 실험에는 한 명의 기증자가 사용되었습니다. 장 조직 샘플 준비채취한 ~10인치(25cm)의 장 조직 샘플을 ~400mL의 얼음 냉장 수집 완충액(PBS+ 항생제/항진균제)에 넣고 실험실로 운송하기 위해 얼음 위에 놓습니다. 수술용 가위(예: 마요네즈 가위)와 겸자(예: 애드슨 집게)를 사용하여 장 조직 샘플에서 과도한 지방과 장간막을 제거합니다. 티슈를 두 개의 동일한 조각으로 자릅니다. 수술용 가위로 조직을 세로로 열고 멸균 PBS에서 조직을 헹굽니다. 멸균 유리 현미경 슬라이드의 측면을 사용하여 장 샘플의 점액층을 부드럽게 제거하고 신선한 PBS로 조직을 헹굽니다.참고: 이 단계는 융모를 제거하는 데 도움이 되며 후속 단계에서 크립트 분획의 순도를 높이는 데 도움이 됩니다. 각 5인치(13cm) 조각에 대해 조직을 2.5인치(6.5cm) 두 개로 자른 다음 각 조각을 거의 동일한 4개의 작은 조각으로 잘라 조직 해리를 용이하게 합니다. 장 조직의 해리멸균된 50mL 코니컬 튜브에 20mL 부피의 조직 해리 시약 #1을 준비하고 부피 변위로 인해 반월상 연골이 원뿔형 튜브의 20mL 표시에서 35mL 표시로 이동할 때까지 작은 조직 샘플을 원뿔형 튜브에 증착합니다. 나머지 소장 조직 샘플 조각에 대해 위의 단계를 반복합니다. 파라필름으로 원추형 튜브를 밀봉하고 원뿔형 튜브를 수동으로 10회 흔듭니다.알림: 프로토콜 전반에 걸쳐 수동 흔들기는 의도적이지만 부드러운 방식으로 수행되어야 합니다. 원뿔형 튜브를 궤도 흔들림 플랫폼의 용기에 있는 얼음 위에 수평으로 놓습니다. 분당 회전수(rpm) 30회(80분)로 용기의 얼음 위에서 원뿔형 튜브를 흔듭니다. 10분마다 원뿔형 튜브를 수동으로 흔듭니다. 50mL 코니컬 튜브에 20mL 부피의 예열된(37°C) 조직 해리 시약 #2(위와 같이 제형화되었지만 DTT는 없음)를 준비합니다. 해리 시약 #1이 들어 있는 원추형 튜브의 조직 샘플을 해리 시약 #2가 들어 있는 원뿔형 튜브에 증착합니다. 파라필름으로 원추형 튜브를 밀봉하고 원뿔형 튜브를 수동으로 10회 흔듭니다. 원뿔형 튜브를 예열된(37°C) 진탕 수조에 넣고 약 60°C 각도로 기울이고 150rpm에서 10분 동안 흔들고 5분 후 수동으로 흔들고 총 10분 배양 후 다시 흔들어 줍니다. crypt 조각의 격리라벨 10 멸균 원뿔형 튜브 #1 – #10. 라벨이 부착된 각 원뿔형 튜브에 20mL의 멸균 얼음처럼 차가운 PBS를 추가합니다. 해리 시약 #2가 들어 있는 원추형 튜브의 조직 조각을 얼음처럼 차가운 PBS #1이 들어 있는 새로운 멸균 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 원추형 튜브를 수동으로 10번 흔듭니다. 원뿔형 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 얼음 위에 수평으로 놓습니다. 궤도 셰이커의 원뿔형 튜브를 80rpm에서 10분 동안 흔듭니다. 10분 후 원뿔형 튜브 #1을 수동으로 10회 흔듭니다. 이것은 세척 #1로 간주됩니다. 한 쌍의 수술용 집게를 사용하여 조직 샘플을 원추형 튜브 #2로 부드럽게 옮깁니다. 2.3.2 – 2.3.4 단계를 반복하면 세척 #2로 간주됩니다. 세탁 #10까지 세탁을 반복합니다. 각 세척의 상층액에는 장내 생성에 사용될 크립트가 포함되어 있습니다. 10회 세척이 모두 완료될 때까지 상층액이 포함된 튜브를 4°C로 유지합니다. 10차 세척이 완료되고 조직 절편을 폐기한 후, 원뿔형 튜브 #6-#10의 상층액을 400 x g에서 400 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 분리된 크립트를 펠릿화합니다.알림: 세척 6-10에는 제한된 파편과 단일 세포가 있는 온전한 크립트의 가장 깨끗한 부분이 포함되어 있습니다. 따라서 이러한 분획물만 엔테로이드 생성에 사용하고 이전 세척(#2-#5)은 폐기하는 것이 좋습니다 상층액을 버리고 4mL의 신선하고 얼음처럼 차가운 PBS를 재현탁 없이 크립트에 추가합니다(이렇게 하면 현미경 검사까지 조각을 손상되지 않은 상태로 유지하는 데 도움이 됩니다). 현미경으로 각 원뿔형 튜브 #6-#10에 대한 해리된 크립트의 순도를 평가합니다.50 μL의 PBS를 384웰 플레이트에 추가합니다. PBS에 10μL의 크립트 현탁액을 추가하고 40x 배율 대물 렌즈를 사용하여 크립트 순도, 무결성 및 계수를 측정합니다.알림: 접시 바닥에 십자가를 잘 그리면 계산이 더 쉬워집니다. 3. 소 회장 장내염의 생체 외 생성 및 통과(그림 2) 참고: 가장 순수하고 온전한 장 크립트가 있는 원추형 튜브의 크립트는 다운스트림 분석에 사용됩니다. 크립트 및 엔테로이드와 관련된 모든 단계에서 피펫 팁, 셀 스크레이퍼 및 튜브는 코팅 버퍼로 사전 코팅되어야 하며 크립트의 손실을 방지하기 위해 기포를 피해야 합니다. 달리 명시되지 않는 한, 1000μL 피펫 팁을 사용하여 크립트 조각이 부서지는 것을 방지해야 합니다. 크립트 조각에서 장내염 생성가장 순수한 crypt 분획(보통 #6-#10)을 하나의 원뿔형 튜브로 결합합니다. 크립트가 들어 있는 원뿔형 튜브를 400 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다. 피펫으로 흡입하여 상층액을 버리고 크립트 펠릿을 Wash Media에 재현탁합니다. 3.1.2 단계에서와 같이 원심 분리기. 상층액을 디캔팅하고 2mL의 세척액을 크립트 펠릿에 추가합니다. 2.3.11.1단계에 설명된 대로 crypt 수를 계산합니다. 3.1.2단계에서와 같이 원심분리하여 크립트를 펠릿화하고, 상층액을 버리고, 얼음처럼 차가운 100% 감소된 성장 인자 기저막 세포외 기질(BME)에 재현탁하여 약 400 crypts/100 μL의 농도를 달성합니다.알림: 온도 변화가 일관성을 변화시키므로 BME를 4°C에서 적절하게 해동하는 것이 중요합니다. BME는 냉각 블록과 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 조기에 응고되는 것을 방지할 수 있습니다.다른 기저막 매트릭스 제형을 사용하면 돔을 생성할 때 BME를 희석해야 할 수 있습니다. 사용 중인 BME와 관련된 제조업체 지침을 참조하십시오. BME의 지하실을 완전히 매달기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다. 최대 8개의 돔/웰을 사용하여 37°C로 설정된 온난화 플레이트에서 50μL의 crypt-BME 현탁액을 6웰 조직 배양 플레이트에 천천히 피펫팅하여 crypt-BME 돔을 만듭니다.참고: 6웰 플레이트는 돔을 도금하기 전에 밤새 37°C의 인큐베이터에서 예열해야 합니다. 6-웰 플레이트를 1분 동안 온난화 플레이트에 유지한 후 플레이트를 37°C, 5% CO2 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다. 2분 후 뚜껑이 아래를 향하도록 6웰 플레이트를 뒤집고 돔이 중합될 수 있도록 추가로 30분 동안 배양합니다. 30분 후 10μM SB202190, 0.5μM LY2157299 및 10μM Y-27632가 보충된 실온(RT) 장내 성장 배지 3mL를 돔이 들어 있는 웰에 조심스럽게 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양합니다. 배지를 제거하고 2-3일마다 억제제가 보충된 새로운 장내 성장 배지로 교체하십시오. 장내 노이의 통과7-10일 후, 크립트가 그림 2E와 같이 많은 싹트는 구조를 가진 3D 장내를 형성하고 통과할 준비가 되었는지 확인합니다. 돔이 들어있는 우물에서 매체를 버리십시오. 웰당 4개의 돔마다 10μM Y-27632가 보충된 얼음처럼 차가운 비효소 세포 해리 용액 1mL를 돔이 포함된 각 웰에 추가합니다. 사전 코팅된 세포 스크레이퍼를 사용하여 조직 배양 플레이트에서 돔을 부드럽게 분리합니다. 15mL 원뿔형 튜브에 장내항체를 수집하고 위아래로 10회 피펫팅하여 삼중합니다. 조각난 장염체가 들어 있는 원뿔형 튜브를 RT에서 80rpm의 궤도 셰이커에서 10분 동안 배양합니다. 장내류에 10μM Y -27632의 얼음처럼 차가운 세척 배지 10mL를 추가합니다. 원뿔형 튜브를 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 10mL의 새 세척 배지에 재현탁시킨 다음 새 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 원뿔형 튜브를 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 1.5mL 미세 원심분리 튜브의 엔테로이드 성장 배지 1mL에 재현탁시킵니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 장내 펠릿을 얼음처럼 차가운 100% BME에 재현탁시키고 3.1.6-3.1.13 단계를 따릅니다. 7일마다 장내구 재통과. 확장 시간은 밀도, 생존 가능성 및 발아 정도에 따라 달라질 수 있습니다. 큰 장내형 구조를 만드는 여러 개의 싹트는 구조는 장내골이 통과해야 함을 나타냅니다. 장내 냉동 보존냉동 보존의 경우 장내세포가 배양에서 5회 이상 통과하지 않도록 합니다.참고: 이것은 실험적으로 테스트되지 않았으며 이후 구절이 실행 가능성을 감소시키고 다양한 결과를 산출한다는 저자의 관찰을 기반으로 합니다. 엔테로이드를 수확하려면 3.2.2-3.2.9 단계에 설명된 대로 해리 완충액을 사용하십시오.참고: 5mL 피펫을 사용하여 장내염체를 기계적으로 해리합니다. 2.3.11.1단계에서 설명한 대로 장내 단편의 수를 계산합니다. 원뿔형 튜브를 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 10μM Y-27632가 보충된 동결 보존 배지에 장내 단편을 재현탁시켜 ~2000 장내 단편/mL의 농도를 달성하고 사전 라벨링된 극저온 추출에 1mL를 분취합니다. 극저온 냉결 용기에 넣고 -80°C에서 밤새 보관합니다. 장기 보관을 위해 극저온을 증기상 액체 질소로 옮깁니다. 장낭 조각의 소생술인큐베이터 내부에 밤새 6웰 플레이트를 놓습니다. 5mL 튜브에 5mL의 코팅 배지를 사전 코팅합니다. 액체 질소 저장소에서 극저온을 제거합니다. 해동된 후 즉시 크립트를 극저온 저온에서 사전 코팅된 5mL 튜브로 옮깁니다. 세척 배지로 냉동 공기를 헹구고 5mL 튜브에 넣습니다. 거품을 피하십시오. 세척 배지를 사용하여 부피를 5mL까지 올리고 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 중에 1.5mL 튜브를 코팅 배지로 사전 코팅합니다. 원심분리 후 상층액을 붓고 튜브에 남아 있는 배지에 펠릿을 재현탁시킨 다음 사전 코팅된 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 세척 배지로 5mL 튜브를 세척하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 400 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 장내 성장 배지로 부피를 1.5mL까지 끌어올립니다. 위와 같이 원심분리기(3.4.7단계)하고 조심스럽게 흡입합니다. 4 °C에서 BME를 가져 와서 얼음 / 얼음 블록 위에 놓습니다. 장내 펠릿을 얼음처럼 차가운 100% BME에 재현탁시키고 3.1.6-3.1.12 단계를 따릅니다. 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 4. 3D 장내체에서 2D 단층의 생성 및 평가 참고: 위와 같이 크립트 및 엔테로이드와 관련된 모든 단계에서 피펫 팁, 셀 스크레이퍼 및 튜브는 코팅 버퍼로 사전 코팅되어야 하며 크립트의 손실을 방지하기 위해 기포를 피해야 합니다. 2D 단층 형성을 위한 트랜스웰 인서트 준비인서트를 24웰 조직 배양 어댑터 플레이트에 넣고 1μm PET 24웰 세포 배양 인서트의 정점 쪽을 장내 성장 배지에 1:15 희석한 100μL의 BME로 사전 코팅합니다. 배리어 무결성 측정을 수행할 때 컨트롤로 사용할 추가 인서트를 항상 코팅하십시오. 코팅된 인서트를 인큐베이터의 24웰 조직 배양 어댑터 플레이트에 놓습니다.알림: 특정 어댑터 또는 동반 조직 배양 플레이트는 트랜스웰 삽입물과 함께 사용해야 합니다. 배양 삽입물을 37°C, 5%CO2 에서 1시간 동안 배양하여 중합을 허용합니다.참고: BME 코팅 트랜스웰은 파라필름으로 밀봉할 수 있으며 즉시 사용하지 않을 경우 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 배양이 끝나면 3D 장내배양 배지를 흡인합니다. 3D 장내염체의 해리위의 섹션 3.1에서 설명한 대로 소생, 도금 및 배양된 냉동 보존된 장내 단편으로부터 2D 장내형 단층을 생성하여 3D 장내류를 형성합니다. 해동된 장내유체를 최소 2회 통과시키고, 마지막 절개는 2D 단층 배양을 생성하기 위해 처리하기 전에 최소 5일 동안 배양합니다. 장형 돔에 10μM Y-27632가 보충된 얼음처럼 차가운 세척 배지를 첨가하여 장류를 수확합니다(4개의 돔에 약 1mL의 해리 완충액 사용). 셀 스크레이퍼로 돔을 분리하고 15mL 코니컬 튜브에 모읍니다. 1mL 피펫 팁을 사용하여 30회 Triturate하여 장내 절편을 생성합니다. 200μL 피펫 팁으로 40회 트라이튜레이트하여 장내 절편을 추가로 분해합니다. 장내 절편이 있는 15mL 원뿔형 튜브의 부피를 얼음처럼 차가운 세척 배지를 사용하여 10mL로 가져옵니다. 원뿔형 튜브를 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리합니다. BME 층을 포함한 상층액을 흡입하여 장내 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.알림: BME 층은 펠릿 바로 위에 흐린 젤라틴 층으로 나타납니다. 4개의 돔마다 10μM의 Y-27632가 보충된 예열된 TrypLE 급효소 1mL에 펠릿을 재현탁시킵니다. 장내 TrypLE 혼합물을 24웰 플레이트에 넣고 37°C, 5%CO2 에서 10분 동안 배양합니다. 10분 후 1mL 피펫을 사용하여 장내-TrypLE 혼합물을 40회 피펫하여 장내이드를 추가로 조각화합니다. 그런 다음 피펫 단편을 200μL 피펫으로 40회 분할하여 단편을 단일 세포로 분해합니다. 멸균 22G 바늘이 부착된 3mL 또는 5mL 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 4회 흡입 및 분주하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 2.3.11.1단계에서 설명한 대로 장세포의 80%가 단일 세포로 분해될 때까지 현미경으로 세포 해리를 모니터링합니다. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 모으고 10% FBS가 보충된 세척 배지 4배를 추가하여 효소 반응을 소멸시킵니다. 사전 코팅된 40μm 셀 스트레이너를 통해 엔테로이드를 50mL 코니컬 튜브에 두 번 여과합니다. 원뿔형 튜브를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 단일 세포를 펠렛화합니다. 트랜스웰 인서트의 2D 단층 파종.상층액을 디캔팅하고 RT에서 20% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 소량(~600μL)의 오가노이드 성장 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다. Trypan Blue 염료 배제 방법, 혈구계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 장내 세포 밀도 및 생존율을 측정합니다. 평균 75%의 생존율이 예상됩니다. 세포를 파종하기 직전에 세포 배양 삽입물에서 1.3단계에서 적용된 여분의 코팅 용액을 조심스럽게 제거합니다. 사전 코팅된 세포 배양 인서트의 정점 표면에 삽입물당 200μL의 부피로 1 x 105 개 세포로 단일 세포를 파종합니다. 20% FBS가 보충된 700μL의 완전한 배지를 세포 배양 삽입물의 기저측에 추가합니다. 플레이트를 숫자 10 모양으로 8회 조작하여 셀이 인서트 위로 고르게 퍼질 수 있도록 합니다. 생물 안전 캐비닛에서 10분 동안 접시 위의 접시를 예열하십시오. 플레이트를 37 °C 및 5 % CO2 에서 배양합니다. 48시간 후, 정점 및 기저 구획의 배지를 20% FBS 및 억제제가 보충된 새로운 장내 성장 배지로 교체합니다. 셋째 날에는 정점 및 기저측 구획에서 배지를 제거하고 1x PBS로 삽입물을 조심스럽게 세척한 다음 억제제만 보충된 장내 분화 배지로 교체합니다. 2-3일마다 두 구획의 미디어를 교체하십시오. 상피 장벽 무결성 및 단층 밀도의 정량적 측정알림: 장벽 무결성은 상피 전압계를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정하여 평가할 수 있습니다.인큐베이터에서 트랜스웰 배양 플레이트를 제거하고 생물 안전 캐비닛에서 몇 분 동안 RT에서 평형을 이루도록 합니다. STX2 전극이 사전 컨디셔닝되고 전압계가 제조업체의 지침에 따라 1000Ω으로 보정되었는지 확인하십시오. 프로브의 긴 스틱을 기저외측 구획에 삽입하고 짧은 끝을 transwell 상피 세포 배양의 정점 구획에 삽입합니다. 단층을 방해하거나 인서트를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 안정되면 셀이 없는 인서트를 포함하여 트랜스웰 인서트당 3개의 TEER 측정값을 기록합니다. 각 인서트에 대한 측정값의 평균을 구합니다. 실험 웰의 평균 측정값에서 블랭크 웰의 평균 측정값을 뺀 다음 삽입물의 표면적을 곱하여 상피 장벽의 저항을 결정하여 보정된 TEER 값을 계산합니다(TEER [Ω.cm2] = [Rcell 레이어 – Rblank] × 면적).