생쥐의 순환 황체 형성 호르몬을 유도하고 측정하기 위한 자동 혈액 샘플링과 결합된 원격 신경 세포 활성화

모든 동물 시술은 실험동물의 관리 및 사용에 관한 국가연구위원회(National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)18 및 연방, 주 및 지역 법률에 따라 수행됩니다. 4마리의 C57BL/6J 암컷과 4마리의 Kiss1-Cre를 포함하여 성인 암컷 마우스(3-6개월령)가 이 프로토콜 시연에 사용되었습니다. ChR2-eYFP(Kiss1-eYFP) 암컷. 생쥐는 12:12 빛:어둠 주기 하에서 22°C에서 온도를 조절하고 저식물성 에스트로겐 식단으로 임시 리비텀 을 먹였습니다. 절차 및 프로토콜은 University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC, Animal Protocols: PRO00010420 and PRO00010138)의 승인을 받았습니다. 1. 특정 세포 집단에 대한 AAV의 입체 전달 수술 준비모든 도구를 소독하십시오. 각 포장이 5마리 이하의 동물에게 사용되도록 여러 개의 수술 도구 패키지를 준비합니다. 멸균 장갑을 준비하고, 각 동물당 최소 한 켤레를 준비하십시오. 천천히 꾸준히 주입되고 쉽게 막히지 않는 길고 얇은 마이크로피펫의 경우 가열 1: 915, 가열 2: 630, 당기기: 630 설정(재료 표 참조)을 사용하여 주입을 위해 유리 마이크로피펫을 당깁니다. 각 풀러에 대해 이러한 설정을 최적화합니다. 지정된 수술 공간에서 수술을 시행합니다. 수술 표면을 70% 에탄올로 소독합니다. 수술 부위의 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 드레이프를 사용하십시오. 깨끗한 실험복이나 일회용 가운과 마스크를 착용하십시오. 흡입 마취 시스템을 준비합니다. 산소 공급 장치를 열고 유량을 0.8L/min으로 조절합니다. 외과마우스를 마취 상자에 넣고 이소플루란을 2.5%까지 엽니다. 초기 유도 후 이소플루란 흐름을 2%로 줄입니다. 절차 전반에 걸쳐 흐름을 유지하십시오. 대체 마취 방법은 동물 프로토콜 및 지역 윤리 위원회 지침을 참조하십시오. 선제적 진통제(카프로펜 5mg/kg s.c.)를 동물 사용 위원회 권장 사항 및 현지 규정에 따라 주사합니다. 가위를 사용하여 마우스 머리를 면도하십시오. 동물을 입체 테이블에 설치하고 이어 바를 놓고 헤드가 올바르게 고정되고 안정적인지 확인하십시오. 마우스의 입을 마우스피스에 고정하고 질식을 방지하기 위해 혀를 입 바깥쪽으로 놓아야 합니다. 수술을 시작하기 전에 동물이 발가락 꼬집음으로 깊이 마취되었는지 확인하고 수술 내내 쥐의 호흡과 색상을 모니터링하십시오. 마우스 아래에 고도 지지대를 배치하여 몸과 머리가 수평 위치에 수평을 유지하도록 합니다. 종이로 덮인 따뜻한 패드로 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 건조하지 않도록 양쪽 눈에 눈 연고를 바르십시오. 수술 부위를 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오. 멸균 장갑을 착용하십시오. 피부를 열기 전에 요오드와 알코올로 쥐의 머리를 소독하십시오. 메스를 사용하여 정중선을 따라 대략 눈 뒤에서 람다 봉합사 뒤까지 머리의 피부를 자릅니다. 두개골을 노출된 상태로 유지하고 멸균 0.9% NaCl이 포함된 면봉으로 청소합니다. 로스트랄 코 정맥(RRV)을 찾아 멸균 연필로 표시합니다. 나머지 절차에는 스테레오스코프를 사용합니다.참고 : RRV를 전후 참조로 사용하여 더 나은 결과를 얻을 수 있지만 bregma를 참조로 사용하는 것이 표준입니다. 멸균 바늘을 참조로 사용하여 입체 측정을 진행하기 전에 뇌 방향이 올바른지 확인하십시오. 또한 RRV와 람다에서 두개골 표면의 높이와 측면 기울기가 동일한지 확인하십시오(± 0.02mm).참고: 측면 기울기는 더 많은 측면 뇌 구조에 주입하는 것과 더 관련이 있습니다. 멸균 유리 피펫에 주입할 바이러스 용액을 로드합니다. 참조 0 전후(AP)에 대한 RRV 참조로 가져옵니다. 시상 봉합사를 따라 선택한 AP 좌표로 이동합니다. 멸균 연필로 이 위치를 표시하고 바늘을 들어 올린 다음 개두술을 진행합니다. 상부 시상동이 부러지지 않도록 표시된 위치 주위에 작은 원을 조심스럽게 뚫습니다. 드릴링하는 동안 압력을 줄이기 위해 드릴을 수직이 아닌 기울어진 위치에 배치하십시오. 작은 집게로 두개골 조각을 제거하십시오. 혈관이 노출되면 상시동의 중앙을 사용하여 내측(ML) 기준(지점 0)으로 사용합니다. 이것은 시상 봉합사를 사용하는 것보다 더 정확합니다. 선택한 ML 위치로 이동합니다. 피펫을 내려 등쪽(DV) 기준(지점 0)으로 경막을 접촉합니다. 경막을 약간 부수고 피펫을 선택한 DV 위치로 내려갑니다. 원하는 양의 AAV(50-200nL)를 주입하고 적절한 액체 분산을 위해 캐뉼라를 3분 동안 제자리에 두십시오. 뇌에서 피펫을 조심스럽게 꺼냅니다. 이어 바에서 마우스를 뗍니다. 수술용 클립이나 선택한 방법을 사용하여 피부를 닫습니다. 회복을 위해 동물을 따뜻한 별도의 케이지에 넣으십시오. 마우스가 깨어난 후의 회복, 반응 및 활동을 모니터링합니다. 완전히 복구되면 마우스를 원래 케이지로 다시 옮깁니다. 절차의 두 번째 부분을 진행하기 전에 바이러스 발현을 위해 최소 3-4주 동안 기다리십시오. 2. 경정맥 및 경동맥 캐뉼레이션 수술 준비지정된 수술 공간에서 수술을 시행합니다. 시술을 시작하기 전에 수술 표면을 70% 에탄올로 소독하십시오. 각 포장이 5마리 이하의 동물에게 사용되도록 여러 개의 수술 도구 패키지를 준비합니다. 모든 수술 기구를 오토클레이브합니다. 그런 다음 멸균수 또는 식염수로 세척하고 수술 사이에 최소 15초(제조업체의 지침에 따라) 동안 뜨거운 비드 멸균기로 도구를 소독합니다. 수술 부위의 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 드레이프를 사용하십시오. 깨끗한 실험복이나 일회용 가운과 마스크를 착용하십시오. 경동맥과 경정맥의 캐뉼레이션을 위한 마이크로 카테터를 준비합니다. 미세레나단 튜브(0.025인치 외경[OD] x 0.012인치 내경[ID]에서 연장됨)의 작은 세그먼트를 실라스틱 튜브(0.025인치 OD x 0.012인치 ID)와 결합하여 동맥 카테터를 구성합니다. 정맥 카테터는 실라스틱 튜브(0.025인치 OD x 0.012인치 ID)만 사용하여 구성합니다. 수술 전 밤새 모든 카테터를 70% 에탄올에 담그십시오. 두 카테터의 절단된 끝을 동물의 체중과 길이에 따라 미리 추정된 길이로 45°로 경사지게 합니다. 수술 절차탁상용 저유량 이소플루란 시스템으로 2% 미만의 동물을 마취하여 수술 중 마취 단계와 평면을 정밀하게 제어합니다. 진통제(카프로펜 5mg/kg s.c.)를 선제적으로 주사하고 안과 연고를 발라 건조 및 각막 손상을 예방합니다. 목의 복부와 뒤쪽 부위를 면도하고 70% 에탄올을 번갈아 가며 요오드 스크럽 3개로 피부를 청소합니다. 견갑골 사이의 수직 피부 절개부(12mm)를 자르고 나중에 사용할 수 있도록 수술용 거즈로 덮습니다. 머리를 외과 의사를 향하게 하여 동물을 앙와위 자세로 놓습니다. 아래에 설명된 절차의 대부분의 부분에 스테레오 색인 범위를 사용합니다. 쇄골 위쪽의 목 오른쪽에 작은 수직 절개(~10mm)를 하여 오른쪽 경동맥과 경정맥을 노출시킵니다. 가위로 피부를 절개하고 끝이 가는 톱니가 없는 미세 집게를 사용하여 피하 조직을 분리하는 둔기 절개를 수행하여 오른쪽 외부 경정맥과 오른쪽 총경동맥을 노출시킵니다. 경정맥의 말단부를 묶어 혈류를 멈추게 하고 무너진 정맥에 미세 집게와 가위를 사용하여 작은 구멍을 뚫습니다. 정맥 카테터를 경사 아래로 삽입하고 한 쌍의 마이크로 겸자를 사용하여 근위부로 삽입하여 상대정맥을 통해 우심방 높이에 도달하도록 전진시킵니다. 삽입 길이는 10g 희박 마우스의 경우 ~12-30mm입니다. 7-0 실크 봉합사를 사용하여 혈관에 고정할 카테터를 묶습니다.알림: 카테터를 올바른 위치에 놓으면 혈액을 쉽게 빼낼 수 있습니다. 그렇지 않으면 카테터가 외측 흉부 정맥에 잘못 삽입되어 다시 삽입해야 할 수 있습니다. 결합 조직을 조심스럽게 절개하여 흉골 설근, 흉골 유돌근 및 이위 근육으로 둘러싸인 삼각형 영역에 위치한 오른쪽 총경동맥을 노출시킵니다. 필요한 경우 와이어 견인기를 사용하여 이러한 근육을 분리하십시오. 7-0 실크 봉합사를 사용하여 내부 및 외부 경동맥의 분기 수준에서 동맥을 묶습니다. 풀린 두 개의 봉합사 루프를 근접하게 배치합니다. 교체된 봉합사 고리를 당겨 혈류를 일시적으로 멈추고 마이크로 가위나 27G 바늘을 사용하여 혈관 벽에 작은 구멍을 자르거나 구멍을 뚫습니다. 동맥 카테터를 경사 아래로 삽입하고 대동맥 판막에 닿지 않고 미리 추정된 길이로 근접하게 삽입합니다. 삽입 길이는 9g의 린 마우스의 경우 ~10-30mm입니다. 두 개의 교체된 봉합사를 사용하여 혈관에 고정할 카테터를 묶습니다. 모든 카테터를 피하로 터널링하고 미리 절단된 절개를 통해 목 뒤쪽에서 외부로 만들고 25G 바늘 튜브로 만든 실리콘 코팅 튜브 커넥터의 정맥 또는 동맥 포트에 연결합니다: 2개의 25G 바늘 튜브와 2개의 4.0cm PE-20 튜브를 사용하여 수정된 MASA19 , 작은 금속 와이어로 만든 링으로 부착된 2.0cm 0.062인치 ID 실라스틱 튜브로 슬리브. 커넥터를 포함한 각 카테터의 총 루멘 부피는 6-8μL입니다(그림 1A). 복부 절개 부위를 봉합하고 봉합사로 등피부를 봉합할 때 커넥터를 피하로 고정합니다. 양쪽 카테터를 헤파린화 식염수(200U/mL)로 채우고 끝 부분을 스테인리스 스틸 수술용 와이어로 단단히 꽂습니다. 마우스는 몇 분 안에 이소플루란 마취에서 회복되고 5일 이내에 수술 후 완전히 회복됩니다. 수술 후 24시간 후에 동물을 자동 채혈 하우징 챔버에 넣고 시스템의 테더 후크를 목 뒤쪽에 이식된 튜브 커넥터에 부착된 금속 링에 연결하여 시스템에 연결합니다. 샘플링이 시작되기 24시간 전에 동맥 및 정맥 카테터를 각각 주사 및 샘플링 라인에 연결합니다(그림 1B). 샘플링 라인의 총 길이는 길이 55cm 또는 루멘 부피 기준 40μL입니다.알림: 주입 및 샘플링 라인의 설정, 수집 방법의 프로그래밍 및 자동 혈액 샘플러 시스템의 케이지 균형 메커니즘은20,21에 자세히 설명되어 있습니다. 이 시스템은 20분마다 10μL의 헤파린화 식염수를 자동으로 전달하여 카테터를 열린 상태로 유지합니다. 시스템의 컴퓨터 프로그램을 통해 사전 주입 샘플링, 주입 및 주입 후 샘플링 시간 및 주파수를 설정합니다. 현재 설정은 아래 3.1단계를 참조하십시오. 이 시스템은 마우스의 움직임(21 )과 반대 방향으로 하우징 챔버를 회전시키면서 마우스의 움직임을 감지함으로써 샘플링 및/또는 주입 라인을 엉키지 않고 동물이 자유롭게 이동할 수 있도록 한다(그림 1). 주입 또는 주입 라인을 화합물로 다시 채우고 주입 또는 주입이 시작되기 최소 2시간 전에 정맥 카테터에 다시 연결합니다.참고: 수술 합병증이 발생할 수 있으며, 회복을 위해 그리고 수술 후 며칠 동안 동물을 면밀히 모니터링해야 합니다. 올바른 모니터링, 살처분 요구 사항 및 절차에 대해서는 동물 프로토콜을 참조하십시오. 3. 자동 채혈 및 정맥 주사 자동 채혈이 프로토콜을 따르려면 20.0μL의 샘플링 부피를 사용하고 샘플당 10.0분마다 샘플링 주파수를 갖도록 각 샘플링 사이의 간격(즉, 7.0분)을 설정합니다. 최대 속도는 s를 s하는 것입니다.amp3.0분/샘플로 연속적으로; 가능한 최소 샘플링 부피는 5.0μL입니다. 동일한 양의 식염수가 샘플링된 혈액을 대체하고 체액 균형을 유지하기 위해 시스템에 의해 자동으로 반환됩니다. 총 샘플링 시간을 CNO를 정맥 주사하기 전에 30(t = -30 – 0)분, 30(t = 0 – 30)분(0.5mg/kg, 그림 2)으로 설정합니다. 수집된 각 혈액 샘플(20.0μL)은 50μL의 식염수(10U/mL의 헤파린 함유)에 자동으로 희석되고 시스템에 의해 냉장 샘플 캐러셀에 보관된 마이크로튜브에 개별적으로 저장됩니다. 자동 정맥 주사혈액 샘플링이 시작되기 최소 2시간 전에 CNO(0.5mg/kg에서 ~50-60μL의 부피로 개별적으로 계산된 용량)를 다시 채우기 위해 정맥 카테터에서 정맥 라인을 분리합니다. 주입 주사기를 사용하여 라인에서 용액(계산된 부피보다 약간 더 많음)을 수동으로 빼내어 용액과 라인의 기존 식염수 사이에 작은 기포를 남깁니다. 주입 라인을 정맥 카테터에 다시 연결하고 주입 속도를 500μL/min 으로 설정하고 t = 0 샘플링 종료 후 주입 시작 시간을 2분 으로 설정합니다. 각 동물의 총 주입 시간은 5-6초입니다.참고: 필요한 경우 수동 복강 내 주사(IP)로 화합물을 전달할 수도 있지만 혈액 수집 프로토콜 중 또는 그 전에 동물을 방해해야 합니다. 결과에서도 이 대안을 보여줍니다. 4. 동물 관류 및 뇌 채취 (선택 사항) 참고: 이 절차는 뇌가 신경 세포 활성화 또는 다운스트림 반응의 뇌 부위를 분석해야 하는 경우에만 따라야 합니다. 채혈 프로토콜이 끝날 때 채혈 시스템에서 마우스를 분리합니다. 정맥 주사 2시간 후, 바람직한 방법을 사용하거나 다른 곳에 기술된 바와 같이 10% 중성 완충 포르말린(NBF)을 동물에게 관류한다22. 뇌를 절개하고 10%-NBF의 20% 자당에 3시간 동안 보존하여 고정을 계속합니다. 3시간 후, 고정 뇌를 PBS의 20% 자당으로 옮기고 절편할 준비가 될 때까지 4°C에서 보존합니다.참고: cFOS 항원을 가릴 수 있으므로 과고정을 피하십시오. 20% 자당 용액에서 뇌는 용기 바닥으로 가라앉아야 합니다. 냉동 마이크로톰 또는 냉동 유지 장치를 사용하여 절편을 만들고 신경 세포 활성화를 관찰하기 위해 선호하는 방법을 사용합니다(예: cFOS 면역조직화학이 표시됨).참고: 현재 결과에 사용된 항체는 재료 표에 설명되어 있습니다. 5. 시료 처리 및 분석 실험이 끝난 직후 자동 샘플러에서 혈액 샘플을 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 샘플을 14,000× g 에서 30초 동안 회전시킵니다. 플라즈마를 수집합니다. 분석할 때까지 -80°C에서 보관하십시오. 10,23 전에 설명한 대로 LH ELISA로 혈액 샘플을 분석합니다.