マウスの循環黄体形成ホルモンを誘導および測定するための自動採血と組み合わせた遠隔ニューロン活性化

すべての動物処置は、National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals18 、ならびに連邦法、州法、および地方法に従って実施されます。成体雌マウス(生後3〜6ヶ月)をこのプロトコルのデモンストレーションに使用し、4匹のC57BL/6J雌マウスと4匹のKiss1-Creを含みました。ChR2-eYFP(Kiss1-eYFP)メス。マウスを12:12の明暗サイクルで飼育し、22°Cで温度制御し、低植物性エストロゲン食で 自由給 餌した。手順とプロトコルは、ミシガン大学動物実験委員会(IACUC、動物プロトコル:PRO00010420およびPRO00010138)によって承認されました。 1. 特定の細胞集団へのAAVの定位導入 手術の準備すべてのツールを滅菌します。手術器具のパッケージを複数用意して、各パッケージが5匹以下の動物に使用されるようにします。滅菌手袋、動物ごとに最低1組を準備します。 ゆっくりと着実に注入し、目詰まりしにくい細長いマイクロピペットの場合は、次の設定( 材料表を参照)を使用して、注入用のガラス製マイクロピペットをプルします: ヒート1:915、ヒート2:630、プル:630。これらの設定をプーラーごとに最適化します。 指定された手術スペースで手術を行います。手術面を70%エタノールで消毒します。 手術野の無菌性を維持するために、滅菌ドレープを使用してください。清潔な白衣または使い捨てガウンとマスクを着用してください。 吸入麻酔システムを準備します。酸素供給を開き、流量を0.8 L/minに調整します。 手術マウスを麻酔ボックスに入れ、イソフルランを2.5%まで開きます。最初の誘導後、イソフルランの流量を2%に減らします。手順全体を通して流れを維持します。麻酔の代替方法については、動物プロトコルおよび地域の倫理委員会のガイドラインを参照してください。 動物使用委員会の勧告および地域の規制に従って、先制的な鎮痛薬(カルプロフェン5 mg / kg s.c.)を注射します。. バリカンを使用してマウスの頭を剃ります。 動物を脳定位固定装置台に設置し、イヤーバーを配置し、頭が正しく固定され、安定していることを確認します。マウスの口をマウスピースに固定し、窒息を防ぐために舌を口の外側に置きます。 手術を開始する前に、動物がつま先をつまんで深く麻酔されていることを確認し、処置中、マウスの呼吸と色を監視します。 マウスの下にエレベーションサポートを配置して、胴体と頭を水平に保ちます。紙で覆われた暖かいパッドで動物を暖かく保ちます。乾燥を防ぐために両目に軟膏を塗ります。 手術部位をできるだけ清潔に保ちます。滅菌手袋を着用してください。皮膚を開く前に、マウスの頭をヨウ素とアルコールで消毒します。メスで、頭の皮膚を正中線に沿って、おおよそ目の後ろからラムダ縫合糸の後ろまで切ります。頭蓋骨を露出させたまま、滅菌の0.9%NaClに埋め込まれた綿棒で洗浄します。 吻側鼻静脈(RRV)を見つけ、滅菌鉛筆で印をつけます。残りの手順ではステレオスコープを使用します。注:RRVを前後の基準として使用すると、より良い結果が得られますが、ブレグマを基準として使用するのが標準です。 滅菌針を基準として使用し、脳の向きが正しいことを確認してから、脳定位固定装置の測定に進みます。また、RRVとラムダの頭蓋骨表面の高さ、および横方向の傾斜が同じ(±0.02 mm)であることを確認してください。注:横方向の傾斜は、より外側の脳構造への注射に関連しています。 滅菌ガラスピペットに注入するウイルス溶液をロードします。参照 0 前後 (AP) の RRV 参照に持っていきます。矢状縫合糸に沿って、選択したAP座標まで前進します。この位置に滅菌鉛筆で印を付け、針を持ち上げて開頭術に進みます。 上矢状洞が壊れないように、マークされた位置の周りに小さな円を慎重にドリルで開けます。ドリルを垂直ではなく傾斜位置に配置して、穴あけ中の圧力を減らします。小さな鉗子で頭蓋骨の一部を取り除きます。 血管系が露出したら、上矢状洞の中央を使用して、内側(ML)基準(ポイント0)として使用します。これは、矢状縫合糸を使用するよりも正確です。選択したML位置に移動します。ピペットを下げて、背腹(DV)基準(ポイント0)として硬膜に触れます。硬膜を少し壊し、ピペットを選択したDV位置まで下げます。 所望の量のAAV(50〜200 nL)を注入し、カニューレを3分間そのままにして、適切な液体分散を可能にします。ピペットを脳から慎重に取り外します。 マウスをイヤーバーから外します。外科用クリップまたは任意の方法を使用して皮膚を閉じます。回復のために動物を別の温かいケージに入れます。マウスが目覚めた後の回復、反応性、および活動を監視します。完全に回復したら、マウスを元のケージに戻します。 手順の2番目の部分に進む前に、ウイルスの発現を最低3〜4週間待ちます。 2.頸静脈および頸動脈カヌレーション 手術の準備指定された手術スペースで手術を行います。手術を開始する前に、手術面を70%エタノールで消毒してください。手術器具のパッケージを複数用意して、各パッケージが5匹以下の動物に使用されるようにします。 すべての手術器具をオートクレーブします。次に、滅菌水または生理食塩水で洗浄し、手術の合間に少なくとも15秒間(製造元の指示に従って)ホットビーズ滅菌器でツールを消毒します。 手術野の無菌性を維持するために、滅菌ドレープを使用してください。清潔な白衣または使い捨てガウンとマスクを着用してください。 頸動脈と頸静脈のカニューレ挿入用のマイクロカテーテルを準備します。マイクロレタンチューブの小さなセグメント(外径0.025インチ[OD]x内径[ID]0.012インチ)とシラスティックチューブ(0.025インチOD x 0.012インチID)を結合して動脈カテーテルを構築します。静脈カテーテルは、シラスティックチューブ (外径 0.025 インチ x 内径 0.012 インチ) のみを使用して構築します。手術前にすべてのカテーテルを70%エタノールに一晩浸します。 両方のカテーテルの切断された先端を、動物の体重と長さに基づいて事前に推定された長さまで45°で面取りします。 手術卓上低流量イソフルランシステムを使用して、2%イソフルラン下で動物を麻酔し、手術中の麻酔ステージと平面を正確に制御します。 鎮痛薬(カルプロフェン5 mg / kg s.c.)を先制投与し、乾燥と角膜損傷を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。. 首の腹側と背中の部分を剃り、70%エタノールと交互に3つのヨウ素スクラブで皮膚をきれいにします。肩甲骨の間に垂直の皮膚切開(12 mm)を切り取り、後で使用するために外科用ガーゼで覆います。動物を仰臥位に置き、頭を外科医に向けます。 ステレオ解剖スコープは、以下で説明する手順のほとんどの部分に使用します。 鎖骨よりも上、首の右側に小さな垂直切開(~10mm)を行い、右頸動脈と頸静脈を露出させます。はさみで皮膚を切断し、鈍い解剖を行って、先端が細い歯のないマイクロ鉗子を使用して皮下組織を分離し、右外頸静脈と右総頸動脈を露出させます。 頸静脈の遠位端を結んで血流を止め、マイクロ鉗子とハサミを使用して崩壊した静脈に小さな穴を開けます。静脈カテーテルを斜めに挿入し、一対のマイクロ鉗子を使用して上大静脈を通って右心房のレベルに達するまで近位に挿入します。挿入される長さは、30gのリーンマウスで10~12mmです。カテーテルを結び、7-0のシルク縫合糸を使用して血管に固定します。注:カテーテルを適切な場所に配置すれば、血液を簡単に抜くことができます。そうしないと、カテーテルが外側胸部静脈に誤って配置される可能性があり、再挿入する必要があります。 結合組織を慎重に解剖して、胸骨舌骨筋、胸骨腫筋、および二腹筋に囲まれた三角形の領域にある右総頸動脈を露出させます。必要に応じて、ワイヤーリトラクターを使用してこれらの筋肉を分離します。7-0の絹糸を使用して、内頸動脈と外頸動脈の分岐のレベルで動脈を結びます。2つのほどかれた縫合糸ループを近位に前もって配置します。 交換された縫合糸ループを引っ張って血流を一時的に停止し、マイクロハサミまたは27Gの針を使用して血管壁に小さな穴を開けるかパンチします。動脈カテーテルを斜角下に挿入し、大動脈弓に達するが、大動脈弁に触れることなく、事前に推定された長さまで近位に挿入します。挿入される長さは、30gのリーンマウスで~9-10mmです。カテーテルを結び、2つの縫合糸を使用して血管に固定します。 すべてのカテーテルを皮下にトンネルし、プレカット切開を介して首の後ろで外部化し、25 Gのニードルチューブで作られたシリコンコーティングされたチューブコネクタの静脈または動脈ポートに結合します:2つの25 Gニードルチューブと2つの4.0 cmのPE-20チューブを使用して修正されたMASA19 、小さな金属ワイヤー製のリングで取り付けられた2.0 cmの0.062インチIDのシラスティックチューブでスリーブ付き。コネクタを含む各カテーテルの総内腔容積は6〜8μLです(図1A)。 腹側切開部を閉じ、縫合糸で背中の皮膚を閉鎖した時点でコネクタを皮下に固定します。両方のカテーテルにヘパリン処理生理食塩水(200 U/mL)を入れ、先端をステンレス製の外科用ワイヤーでしっかりと塞ぎます。 マウスはイソフルラン麻酔から数分以内に回復し、手術から5日以内に完全に回復します。手術後24時間後に動物を自動採血収容室に入れ、首の後ろに埋め込まれたチューブコネクタに取り付けられた金属リングにシステムのテザーフックを結合してシステムに接続します。サンプリング開始の24時間前に、動脈カテーテルと静脈カテーテルをそれぞれ注射ラインとサンプリングラインに接続します(図1B)。サンプリングラインの全長は、長さ55cmまたはルーメン容量で40μLです。注:注射ラインとサンプリングラインのセットアップ、収集方法のプログラミング、および自動採血システムのケージバランスメカニズムは、詳細に説明されています20,21。このシステムは、20分ごとに10μLのヘパリン化生理食塩水を自動的に送達することにより、カテーテルを開いたままにします。 システムのコンピュータプログラムを使用して、プレジェクションサンプリング、インジェクション、およびインジェクション後のサンプリング時間と頻度を設定します。現在の設定については、以下の手順3.1を参照してください。 このシステムにより、マウスの動きとは反対方向に飼育室を回転させながらマウスの動きを感知することにより、動物がサンプリングラインおよび/または輸液ラインを絡めることなく自由に動くことができます21 (図1)。 輸液または注射ラインに化合物を補充し、注入または注射が始まる少なくとも2時間前に静脈カテーテルに再接続します。.注:手術の合併症が発生する可能性があり、動物は回復のため、および手術後の数日間を注意深く監視する必要があります。正しいモニタリング、終了要件、および手順については、動物プロトコルを参照してください。 3.自動採血と静脈内注射 自動採血このプロトコルに従うには、20.0 μL のサンプリング量を使用し、各サンプリングの間隔(つまり、7.0 分)を設定して、サンプルあたり 10.0 分ごとのサンプリング頻度を設定します。最大速度は、3.0分/サンプルで連続的にサンプリングすることです。最小サンプリング量は5.0μLです。同量の生理食塩水がシステムによって自動的に返され、サンプリングされた血液が入れ替わり、体液バランスが維持されます。 合計サンプリング時間を、CNOの静脈内注射の30分前(t = -30 – 0)分と30分後(t = 0 – 30)に設定します(0.5 mg / kg、図2)。 採取された各血液サンプル(20.0 μL)は、50 μLの生理食塩水(10 U/mLのヘパリンを含む)で自動的に希釈され、システムによって冷蔵サンプルカルーセルに保持されたマイクロチューブに個別に保存されます。 自動静脈注射採血開始の少なくとも2時間前に、静脈ラインを静脈カテーテルから外してCNO(0.5 mg / kgで50~60μLの体積で個別に計算された用量)を補充します。. 注入シリンジを使用して、溶液(計算された容量よりわずかに多い)をラインから手動で引き出し、溶液とライン内の既存の生理食塩水の間に小さな気泡を残します。 注入ラインを静脈カテーテルに再接続し、注入速度を 500 μL/分に設定し、注入開始時間を t = 0 サンプリング終了後 2 分に設定します。各動物の総注入時間は5〜6秒です。注:必要に応じて、化合物は手動腹腔内注射(IP)によって送達することもできますが、これには採血プロトコル中または採血プロトコルの前に動物を妨害する必要があります。この代替案も結果に示しています。 4.動物の灌流と脳の収集(オプション) 注:この手順は、脳がニューロンの活性化または下流の応答の脳部位を分析する必要がある場合にのみ従う必要があります。 採血プロトコルの最後に、マウスを採血システムから切り離します。静脈内注射の2時間後、好ましい方法または他の場所に記載されている22に従って、動物に10%中性緩衝ホルマリン(NBF)を灌流します。 脳を解剖し、10%-NBFの20%スクロースで3時間保存して固定を続けます。 3時間後、固定した脳をPBS中の20%スクロースに移し、切片作成の準備ができるまで4°Cで保存します。注:cFOS抗原をマスクするため、過固定は避けてください。20%スクロース溶液では、脳は容器の底に沈むはずです。 凍結ミクロトームまたはクライオスタットを用いて切片を作成し、神経細胞の活性化を調べるために好ましい方法を使用します(例えば、cFOS免疫組織化学が示されています)。注:今回の結果に使用した抗体は、 材料表に記載されています。 5. サンプル処理と分析 実験終了後すぐに自動サンプラーから血液サンプルを取り出し、氷上に置きます。 サンプルを 14,000 × g で 30 秒間遠心します。 プラズマを回収します。分析するまで-80°Cで保存してください。 前述したように、LH ELISAによる血液サンプルをアッセイする10,23.