远程神经元激活与自动血液采样相结合，以诱导和测量小鼠体内循环黄体生成素

所有动物程序均按照国家研究委员会实验动物护理和使用指南18 以及联邦、州和地方法律执行。成年雌性小鼠（3-6个月大）用于该方案演示，包括4只C57BL / 6J雌性和4只Kiss1-Cre;ChR2-eYFP （Kiss1-eYFP） 雌性。将小鼠保持在12：12的光：暗循环下，温度控制在22°C，并在低植物雌激素饮食 中随意 喂食。程序和协议已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，动物协议：PRO00010420 和 PRO00010138）的批准。 1. AAV的立体定向递送至特定细胞群 手术准备对所有工具进行消毒。准备多包手术工具，以确保每包用于不超过五只动物。准备无菌手套，每只动物至少一副。 使用以下设置（参见 材料表）拉动玻璃微量移液器进行注射，用于缓慢稳定注入且不易堵塞的细长微量移液器： 热 1：915，热 2：630，拉力：630。针对每个拉拔器优化这些设置。 在指定的手术空间进行手术。用 70% 乙醇对手术表面进行消毒。 使用无菌窗帘来保持手术区域的无菌。穿上干净的实验室外套或一次性防护服，戴上口罩。 准备吸入麻醉系统。打开供氧，将流速调节至 0.8 L/min。 手术将鼠标放入麻醉箱中，将异氟烷打开至2.5%。初始诱导后将异氟醚流量降低至2%;在整个过程中保持流畅。有关麻醉的替代方法，请参阅动物方案和当地伦理委员会指南。 按照动物使用委员会的建议和当地法规注射先发制人镇痛药（卡洛芬 5 mg/kg 皮下注射）。 用剪刀剃掉鼠标头。 将动物安装在立体定位台上，放置耳杆，并确保头部正确固定且稳定。将鼠标的嘴固定在咬嘴上，确保将舌头放在嘴外侧以避免窒息。 在开始手术之前，用脚趾捏住动物确认被深度麻醉，并在整个手术过程中监测小鼠的呼吸和颜色。 将抬高支架放在鼠标下方，以保持身体和头部水平处于水平位置。用纸盖住的温暖垫子让动物保持温暖。将眼药膏涂抹在双眼上，以免干燥。 尽可能保持手术区域清洁。戴上无菌手套。在打开皮肤之前，用碘和酒精对老鼠的头部进行消毒。用手术刀沿着中线切开头部的皮肤，大约从眼睛后面到λ缝合线后面。保持颅骨暴露，并用棉签嵌入无菌的 0.9% NaCl 进行清洁。 找到鼻静脉 （RRV） 并用无菌铅笔标记。在程序的其余部分使用立体镜。注意：我们使用 RRV 作为前后参考获得更好的结果，但使用前嵐作为参考是标准的。 使用无菌针头作为参考，在进行立体定位测量之前，确保大脑方向正确。还要确保颅骨表面在RRV和λ处的高度以及侧向倾斜度相同（±0.02毫米）。注意：侧向倾斜度与注射到更多的外侧大脑结构中变得更加相关。 将无菌玻璃移液管装入要注射的病毒溶液。将其带到 RRV 参考值，作为参考值 0 前后 （AP）。沿着矢状缝线前进到选择的 AP 坐标。用无菌铅笔标记这个位置，提起针头，然后进行开颅手术。 小心地在标记位置周围钻一个小圆圈，以免破坏矢状窦上窦。将钻头放置在倾斜位置而不是垂直位置，以降低钻孔时的压力。用小镊子取出头骨的碎片。 一旦脉管系统暴露，使用上矢状窦的中间作为内侧 （ML） 参考（点 0）;这比使用矢状缝合更精确。移动到选择的 ML 位置。降低移液器以接触硬脑膜作为背腹 （DV） 参考（点 0）。轻轻掰开硬脑膜，将移液器下降到所选的DV位置。 注射所需量的AAV（50-200nL）并将套管放置3分钟以充分分散液体。小心地将移液管从大脑中取出。 将鼠标从耳杆上松开。使用手术夹或任何选择的方法闭合皮肤。将动物放在一个单独的温暖的笼子里进行恢复。监视鼠标唤醒后的恢复、反应和活动。完全恢复后，将鼠标移回原来的笼子。 等待至少 3-4 周的病毒表达，然后再进行手术的第二部分。 2.颈静脉和颈动脉插管 手术准备在指定的手术空间进行手术。在开始手术之前，用 70% 乙醇对手术表面进行消毒。准备多包手术工具，以确保每包用于不超过五只动物。 高压灭菌所有手术器械。然后，用无菌水或生理盐水清洁，并在手术之间用热珠消毒器对工具进行至少 15 秒（根据制造商的说明）。 使用无菌窗帘来保持手术区域的无菌。穿上干净的实验室外套或一次性防护服，戴上口罩。 准备用于颈动脉和颈静脉插管的微导管。通过将一小段微肾环管（从 0.025 英寸外径 [OD] x 0.012 英寸内径 [ID] 拉伸）与硅橡胶管（0.025 英寸外径 x 0.012 英寸内径）连接来构建动脉导管。仅使用硅橡胶管（外径 0.025 英寸 x 内径 0.012 英寸）构建静脉导管。手术前将所有导管浸泡在 70% 乙醇中过夜。 根据动物的体重和长度，将两根导管的切割尖端斜角为 45°，直至预先估计的长度。 外科 手术使用台式低流量异氟醚系统麻醉2%以下的动物，以精确控制手术过程中的麻醉阶段和平面。 先发制人剂量的镇痛药（卡洛芬 5 mg/kg 皮下注射）并涂抹眼药膏以防止干燥和角膜损伤。 剃掉颈部的腹侧和背部区域，并用三种碘磨砂膏与70%乙醇交替清洁皮肤。在肩胛骨之间切开一个垂直的皮肤切口（12 毫米），并用手术纱布覆盖以备后用。将动物置于仰卧位，头部朝向外科医生。 在下面描述的大多数程序中使用立体解剖镜。 在颈部右侧，锁骨上方做一个垂直小切口（~10 mm），露出右颈动脉和颈静脉。用剪刀剪开皮肤，并使用带有细尖的非齿微镊子进行钝解剖以分离皮下组织，露出右侧颈外静脉和右侧颈总动脉。 绑住颈静脉的远端以阻止血流，并使用微型镊子和剪刀在塌陷的静脉上切一个小孔。使用一对微型镊子将静脉导管斜面向下插入近端，使其穿过上腔静脉以达到右心房的水平。对于 10 g 瘦鼠，插入长度为 ~12-30 mm。使用 7-0 丝缝线将导管绑扎以固定在血管上。注意：将导管放在正确的位置，可以很容易地抽取血液;否则，导管可能会错位到胸外侧静脉中，需要重新插入。 仔细解剖结缔组织，露出位于胸骨舌骨肌、胸骨乳突肌和二腹肌包围的三角形区域的右侧颈总动脉。如果需要，使用钢丝牵开器将这些肌肉分开。使用7-0丝缝合线将动脉绑在颈内动脉和颈外动脉分叉的水平。在近端放置两个解开的缝合环。 通过拉动预先置换的缝合环暂时停止血流，并使用微型剪刀或 27 G 针在血管壁上切割或打一个小孔。将动脉导管斜面向下插入，并靠近到达主动脉弓的预定长度，但不接触主动脉瓣。对于 9 g 瘦鼠标，插入长度为 ~9-10 mm。使用两条预置缝合线将导管绑扎以固定在血管上。 将所有导管皮下穿过，并通过预切切口在颈部后部将其外部化，并将它们连接到由 25 G 针管制成的硅胶涂层管连接器的静脉或动脉端口：改良的 MASA19 使用两根 25 G 针管和两根 4.0 cm 的 PE-20 管，套管有 2.0 cm 的 0.062 英寸内径硅橡胶管，并附有一个小金属线制成的环。包括连接器在内的每根导管的总管腔体积为 6-8 μL（图 1A）。 闭合腹侧切口，并用缝合线将连接器皮下固定在背部皮肤闭合处。用肝素盐水 （200 U/mL） 填充两根导管，并用不锈钢手术线将它们紧紧塞住。 小鼠在几分钟内从异氟醚麻醉中恢复，并在5天内从手术中完全恢复。手术后24小时将动物置于自动采血室中，并通过将系统的系绳钩连接到连接到植入颈部后部的管道连接器的金属环上将它们连接到系统。在采样开始前24小时，将动脉和静脉导管分别连接到注射和采样管路（图1B）。取样线的总长度为 55 cm，或 40 μL（按流明体积计）。注：注射和采样线的设置、收集方法的编程以及自动血液采样器系统的笼子平衡机制已详细描述20,21。该系统每 20 分钟自动输送 10 μL 肝素盐水，使导管保持打开状态。 通过系统的计算机程序设置注射前取样、注射后和注射后取样时间和频率。有关当前设置，请参阅下面的步骤 3.1。 该系统允许动物自由移动，而不会缠绕采样和/或输液线，通过感应鼠标运动，同时以与鼠标运动相反的方向旋转壳室21 （图1）。 用化合物重新填充输注或注射管路，并在输注或注射开始前至少 2 小时重新连接到静脉导管。注意：可能会发生手术并发症，需要密切监测动物的恢复情况和手术后的几天。有关正确的监测、终止要求和程序，请参阅动物协议。 3.自动采血和静脉注射 自动采血要遵循此方案，请使用20.0μL的采样体积，并在每次采样之间设置一个间隔（即7.0分钟），使每个样品的采样频率为每10.0分钟一次。最大速率是以 3.0 min/样品的速度连续采样;最小可能的采样体积为 5.0 μL。系统会自动返回等量的生理盐水，以替换采样的血液并维持体液平衡。 将 总采样时间 设置为静脉注射CNO前 30 （t = -30-0）分钟和静脉注射CNO后 30 （t = 0-30） 分钟 （0.5mg / kg， 图2）。 每个收集的血液样本（20.0μL）在50μL生理盐水（含有10U / mL的肝素）中自动稀释，并单独储存在系统保存在冷藏样品转盘中的微管中。 自动静脉注射在血液采样开始前至少2小时，将静脉管路与静脉导管断开以重新填充CNO（按体积单独计算的剂量~50-60μL，0.5mg / kg）。 用注射器逆行从管路中手动取出溶液（略大于计算体积），在溶液和管路中现有的盐水之间留下一个小气泡。 将注射管重新连接到静脉导管，并在t = 0取样完成后将注射速率设置为500μL / min，将注射开始时间设置为2 min。每只动物的总注射时间为5-6秒。注意：如果需要，该化合物也可以通过手动腹膜内注射 （IP） 递送，但这需要在采血方案期间或之前干扰动物。我们还在结果中显示了这种替代方案。 4. 动物灌注和脑采集（可选） 注意：仅当需要大脑分析神经元激活或下游反应的大脑部位时，才应遵循此程序。 在采集方案结束时断开小鼠与采血系统的连接。静脉注射后两小时，继续用10%中性缓冲福尔马林（NBF）灌注动物，使用优选方法或如其他地方所述22。 解剖大脑并将其保存在20%蔗糖的10%NBF中3小时以继续固定。 3小时后，将固定脑转移到PBS中的20%蔗糖中，并在4°C下保存，直到准备好切片。注意：避免过度固定，因为这会掩盖 cFOS 抗原。在20%的蔗糖溶液中，大脑应该沉到容器的底部。 使用冷冻切片机或冷冻恒温器进行切片，并使用首选方法观察神经元激活（例如，显示 cFOS 免疫组化）。注意：用于当前结果的抗体在 材料表中进行了描述。 5. 样品处理与分析 实验结束后立即从自动采样器中取出血液样本并将其放在冰上。 将样品以 14,000 × g 旋转 30 秒。 收集血浆。将其储存在-80°C直至分析。 如前所述，通过LH ELISA测定血液样本10,23。