Obtención de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro después de una hemorragia subaracnoidea
Summary
La investigación preliminar confirma que la hemorragia subaracnoidea (HSA) causa la muerte de los pericitos cerebrales. La evaluación de la contractilidad de los pericitos después de la HSA requiere la diferenciación entre pericitos cerebrales viables y no viables. Por lo tanto, se ha desarrollado un procedimiento para marcar pericitos cerebrales viables y no viables simultáneamente en secciones cerebrales, lo que facilita la observación utilizando un microscopio confocal de alta resolución.
Abstract
Los pericitos son células murales cruciales situadas dentro de la microcirculación cerebral, fundamentales para modular activamente el flujo sanguíneo cerebral a través de ajustes de contractilidad. Convencionalmente, su contractilidad se mide observando los cambios morfológicos y los cambios de diámetro capilar cercanos en circunstancias específicas. Sin embargo, la fijación posterior al tejido, la evaluación de la vitalidad y la consiguiente contractilidad pericitaria de los pericitos cerebrales de los que se obtienen imágenes se ven comprometidas. Del mismo modo, el etiquetado genético de los pericitos cerebrales se queda corto a la hora de distinguir entre pericitos viables y no viables, especialmente en afecciones neurológicas como la hemorragia subaracnoidea (HSA), donde nuestra investigación preliminar valida la desaparición de los pericitos cerebrales. Se ha diseñado un protocolo fiable para superar estas limitaciones, que permite el marcaje fluorescente simultáneo de pericitos cerebrales funcionales y no funcionales en secciones cerebrales. Este método de etiquetado permite la visualización al microscopio confocal de alta resolución, marcando simultáneamente la microvasculatura del corte de cerebro. Este innovador protocolo ofrece un medio para evaluar la contractilidad del pericito cerebral, su impacto en el diámetro capilar y la estructura del pericito. La investigación de la contractilidad de los pericitos cerebrales en el contexto de la HSA permite comprender mejor sus efectos sobre la microcirculación cerebral.
Introduction
Los pericitos cerebrales, que se distinguen por sus protuberancias delgadas y cuerpos celulares que sobresalen, rodean la microcirculación 1,2. Mientras que el aumento del flujo sanguíneo cerebral es impulsado predominantemente por la dilatación capilar, las arterias más pequeñas exhiben tasas más lentasde dilatación. La contractilidad pericitaria ejerce influencia sobre el diámetro capilar y la morfología pericitaria, impactando en la dinámica vascular4. La contracción de los pericitos cerebrales conduce a la constricción capilar y, en escenarios patológicos, la contracción excesiva puede impedir el flujo de eritrocitos5. Varios factores, incluida la norepinefrina liberada del locus coeruleus, pueden inducir la contracción de los pericitos cerebrales dentro de los capilares6. Con un papel regulador en el flujo sanguíneo cerebral, los pericitos exhiben síntesis de 20-HOTE, sirviendo como sensor de oxígeno durante la hiperoxia7. La contracción de los pericitos cerebrales provocada por el estrés oxidativo-nitrativo afecta negativamente a los capilares5. A pesar de las investigaciones in vivo y ex vivo sobre la contracción de los pericitos cerebrales8, persiste un conocimiento limitado con respecto a la obtención de imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables dentro de cortes de cerebro.
De manera crucial, las imágenes posteriores a la fijación tisular de los pericitos cerebrales comprometen su vitalidad y la posterior evaluación de la contractilidad. Además, en escenarios como los trastornos neurológicos (p. ej., hemorragia subaracnoidea – HSA), el marcaje transgénico de los pericitos cerebrales no logra diferenciar entre pericitos viables y no viables, como lo confirma nuestro estudio preliminar de muerte de pericitos cerebrales inducida por HSA9.
Para superar estos desafíos, empleamos TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, mientras que los fallecidos se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Utilizamos tecnologías de imágenes confocales de alta resolución para visualizar pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, al tiempo que preservamos la actividad de los cortes durante la obtención de imágenes. Este artículo tiene como objetivo presentar un método reproducible para obtener imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, que sirva como una herramienta valiosa para investigar el impacto de los pericitos cerebrales en la microcirculación cerebral después de la HSA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han desarrollado técnicas de imagen confocal de alta resolución para visualizar los pericitos cerebrales vitales, los pericitos cerebrales no vitales y la microvasculatura en cortes cerebrales. En cortes agudos de cerebro de rata, el proceso implica el marcaje inicial de pericitos con TO-PRO-311, seguido de células endoteliales microvasculares con IB412; posteriormente, se realiza la identificación de los pericitos fallecidos mediante PI. Este protocolo es sencillo, …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81960226,81760223); la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
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