Chemische affiniteit-gebaseerde isolatie van extracellulaire blaasjes uit biovloeistoffen voor proteomics en fosfoproteomics-analyse
Summary
Dit protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor de efficiënte isolatie van extracellulaire blaasjes in de urine met behulp van gefunctionaliseerde magnetische kralen. Bovendien omvat het latere analyses, waaronder western blotting, proteomics en phosphoproteomics.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV’s) uit biovloeistoffen hebben de laatste tijd veel aandacht gekregen op het gebied van vloeibare biopsie. Ze worden vrijgegeven door bijna elk type cel, bieden een real-time momentopname van gastheercellen en bevatten een schat aan moleculaire informatie, waaronder eiwitten, met name die met posttranslationele modificaties (PTM’s) zoals fosforylering, als de belangrijkste speler van cellulaire functies en het begin en de progressie van de ziekte. De isolatie van EV’s uit biovloeistoffen blijft echter een uitdaging vanwege de lage opbrengsten en onzuiverheden van de huidige EV-isolatiemethoden, waardoor de stroomafwaartse analyse van EV-lading, zoals EV-fosfoproteïnen, moeilijk wordt. Hier beschrijven we een snelle en effectieve EV-isolatiemethode op basis van gefunctionaliseerde magnetische kralen voor EV-isolatie uit biovloeistoffen zoals menselijke urine en stroomafwaartse proteomics- en fosfoproteomics-analyse na EV-isolatie. Het protocol maakte een hoog terugwinningsrendement van urinaire EV’s en gevoelige profielen van EV-proteoom en fosfoproteoom mogelijk. Verder komen hier ook de veelzijdigheid van dit protocol en relevante technische overwegingen aan bod.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn membraaningekapselde nanodeeltjes die door alle soorten cellen worden uitgescheiden en aanwezig zijn in biovloeistoffen zoals bloed, urine, speeksel, enz.1,2,3,4. EV’s vervoeren een lading van diverse bioactieve moleculen die de fysiologische en pathologische toestand van hun gastheercellen weerspiegelen en daarom fungeren als cruciale factoren in ziekteprogressie 4,5,6. Bovendien hebben uitgebreide studies aangetoond dat op EV gebaseerde ziektemarkers kunnen worden geïdentificeerd voorafgaand aan het begin van de symptomen of de fysiologische detectie van tumoren 5,6,7.
Fosforylering fungeert als een belangrijk mechanisme in cellulaire signalering en regulatie. Daarom bieden fosfoproteïnen een waardevolle bron voor de ontdekking van biomarkers, aangezien afwijkende fosforyleringsgebeurtenissen geassocieerd zijn met ontregelde cellulaire signaalroutes en de ontwikkeling van metastatische ziekten zoals kanker 8,9,10. Hoewel het profileren van de fosforyleringsdynamiek de identificatie van ziektespecifieke fosfoproteïnesignaturen als potentiële biomarkers mogelijk maakt, vormen de lage abundantie en dynamische aard van fosfoproteïnen grote uitdagingen bij de ontwikkeling van fosfoproteïnen als biomarkers11,12. Met name de laag-overvloedige fosfoproteïnen die zijn ingekapseld in EV’s worden beschermd tegen externe enzymatische vertering in de extracellulaire omgeving8. Bijgevolg bieden EV’s en van EV afgeleide fosfoproteïnen een ideale bron voor de ontdekking van biomarkers bij de vroege detectie van kanker en andere ziekten.
Hoewel analyse van eiwitfosforylering in EV’s een waardevolle bron biedt voor het begrijpen van kankersignalering en ziektediagnose in een vroeg stadium, vormt het gebrek aan efficiënte EV-isolatiemethoden een grote barrière. EV-isolatie wordt gewoonlijk bereikt door differentiële ultracentrifugatie (DUC)13. Deze methode is echter tijdrovend en niet geschikt voor klinische implicaties vanwege de lage doorvoer en slechte reproduceerbaarheid13,14. Alternatieve EV-isolatiebenaderingen, zoals polymeer-geïnduceerde precipitatie15, worden beperkt door een lage specificiteit als gevolg van co-precipitatie van niet-EV-eiwitten. Op affiniteit gebaseerde benaderingen, waaronder op antilichamen gebaseerde affiniteitsvangst16 en affiniteitsfiltratie17, bieden een verbeterde specificiteit, maar zijn beperkt tot een relatief laag herstelpercentage vanwege het kleine volume.
Om de problemen bij het onderzoeken van de dynamiek van fosfoproteïnen in EV’s aan te pakken, heeft onze groep een extracellulaire blaasjes total recovery and purification (EVtrap)-techniek ontwikkeld op basis van chemische affiniteit om EV’s op te vangen op gefunctionaliseerde magnetische kralen18. Eerdere resultaten hebben aangetoond dat deze EV-isolatiemethode op basis van magnetische parels zeer effectief is in het isoleren van EV’s uit een breed scala aan biovloeistofmonsters en in staat is om een veel hogere EV-opbrengst te bereiken terwijl verontreiniging wordt geminimaliseerd in vergelijking met DUC en andere bestaande isolatiemethoden18,19. We hebben met succes gebruik gemaakt van EVtrap en een op titanium gebaseerde fosfopeptideverrijkingsmethode die is ontwikkeld door onze groep20 om het fosfoproteoom van EV’s afgeleid van diverse biovloeistoffen te profileren en om potentiële fosfoproteïne-biomarkers voor verschillende ziekten te detecteren 19,21,22.
Hier presenteren we een protocol op basis van EVtrap voor het isoleren van circulerende EV’s. Het protocol richt zich op de urinaire EV’s. We demonstreren ook de karakterisering van geïsoleerde EV’s met behulp van western blotting. Vervolgens beschrijven we de monstervoorbereiding en de verwerving van massaspectrometrie (MS) voor zowel proteomics- als fosfoproteomics-analyses. Dit protocol biedt een efficiënte en reproduceerbare workflow voor het profileren van het urinaire EV-proteoom en fosfoproteoom, wat verdere studies naar EV’s en hun klinische toepassingen zal vergemakkelijken23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effectieve EV-isolatie is een essentiële voorwaarde voor het detecteren van laagfrequente eiwitten en fosfoproteïnen in EV’s. Ondanks de ontwikkeling van talrijke methoden om aan deze behoefte te voldoen, heeft de meerderheid nog steeds last van beperkingen zoals slecht herstel of lage reproduceerbaarheid, die het gebruik ervan in grootschalige onderzoeken en routinematige klinische omgevingen belemmeren. DUC wordt over het algemeen beschouwd als de meest gebruikelijke methode voor EV-isolatie, en de extra wasstappen w…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is gedeeltelijk gefinancierd door NIH-subsidies 3RF1AG064250 en R44CA239845.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
Referenzen
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
- Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
