基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

细胞外囊泡 （EV） 是由所有类型的细胞分泌的膜包膜纳米颗粒，存在于血液、尿液、唾液等生物流体^中1,2,3,4。EV 携带多种生物活性分子，这些分子反映了宿主细胞的生理和病理状态，因此是疾病进展的关键因素 ^4,5,6。此外，广泛的研究已经确定，基于 EV 的疾病标志物可以在症状出现或肿瘤生理检测之前被识别出来 ^5,6,7。

磷酸化是细胞信号传导和调节的关键机制。因此，磷蛋白为生物标志物的发现提供了有价值的来源，因为异常的磷酸化事件与失调的细胞信号通路和转移性疾病的发展（^如癌症）有关8,9,10。尽管分析磷酸化动力学可以识别疾病特异性磷蛋白特征作为潜在的生物标志物，但磷蛋白的低丰度和动态性质对开发磷蛋白作为生物标志物构成了重大挑战^11,12。值得注意的是，封装在 EV 中的低丰度磷蛋白在细胞外环境中受到保护，免受外部酶消化的影响⁸。因此，EV 和 EV 衍生的磷蛋白为癌症和其他疾病的早期检测中的生物标志物发现提供了理想的来源。

尽管对 EV 中蛋白质磷酸化的分析为了解癌症信号传导和早期疾病诊断提供了宝贵的资源，但缺乏有效的 EV 分离方法是一个主要障碍。EV 隔离通常通过差示超速离心 （DUC）¹³ 实现。然而，这种方法耗时且由于通量低和重现性差而不适合临床意义^13,14。替代 EV 分离方法（例如聚合物诱导沉淀¹⁵）由于非 EV 蛋白的共沉淀而受到低特异性的限制。基于亲和力的方法，包括基于抗体的亲和力捕获¹⁶ 和亲和力过滤¹⁷，可提供增强的特异性，但由于体积小，回收率相对较低。

为了解决探索 EV 中磷蛋白动力学的问题，我们课题组开发了基于化学亲和力的细胞外囊泡全回收和纯化 （EVtrap） 技术，将 EV 捕获到功能化的磁珠上¹⁸。先前的结果表明，与DUC和其他现有分离方法相比，这种基于磁珠的EV分离方法在从各种生物流体样品中分离EV方面非常有效，并且能够实现更高的EV产量，同时最大限度地减少污染^18,19。我们已经成功地利用了 EVtrap 和我们小组²⁰ 开发的钛基磷酸肽富集方法来分析来自不同生物流体的 EV 的磷酸化蛋白质组，并检测各种疾病的潜在磷蛋白生物标志物¹⁹、^21、22。

在这里，我们提出了一种基于EVtrap的协议，用于分离循环的EV。该协议侧重于泌尿 EV。我们还演示了使用蛋白质印迹法对分离的 EV 进行表征。然后，我们详细介绍了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的样品制备和质谱 （MS） 采集。该协议为分析尿液 EV 蛋白质组和磷酸化蛋白质组提供了高效且可重复的工作流程，这将有助于对 EV 及其临床应用的进一步研究²³。