デジタル顕微鏡を用いた細胞死開始の研究

注:セクション1および2では、Lukanらによって概説された方法に基づいて植物材料調製のための修正されたプロトコルについて説明します7。具体的には、制御された環境条件と接種物の準備にいくつかの変更が加えられました。 1.ジャガイモの栽培 健康なジャガイモのCVを育てます。茎節組織培養におけるライワル植物8. 6〜8週間後、滅菌ピンセットとメスナイフを使用して、滅菌条件下で滅菌紙にジャガイモの苗の節を含む長さ1cmの外植片を10個切り取ります。 それらをMurashige and Skoog(MS30)培地(図1A)と一緒にプラスチックの箱に移し、制御された環境条件(250μEまたはμmol/m2/sの放射線と16時間の日長、相対湿度55%±5%)で、明るい場所で22°C、暗所で19°Cで増殖させます。 マイクロプロパゲーションの2週間後に土壌に移します。鉢(r = 10 cm)に土を入れます。鉢の真ん中の土に指で深さ3〜4cmの穴を開け、穴に水を入れて吸収されるのを待ちます。 鉢ごとに1つの植物を穴に入れ、葉を表面の上に残します。根を土でそっと覆います(図1B)。注:一部の植物は根を発達させない場合があります。これらの植物を分析から除外します。 制御された環境条件(光で22°C、暗所で19°C、相対湿度55%±5%、放射量250μmol/m2/s、日長16時間)で、成長チャンバー内の土壌中で植物を育てます。 3〜4週間後、植物の準備が整います。これらの植物を使用して接種します。注:植物には、リーフレットが見える完全に発達した葉が少なくとも3〜4枚必要です(図1C)。PVYによる病変と間違われる可能性のある目に見える症状(黄色または茶色の葉)がなく、健康に見えるはずです。同等の結果を得るには、植物の免疫応答と病変形成に対する概日リズムの影響を回避するために、すべての実験で植物に同時に(例えば、午前9時に)接種する必要があります9,10,11。 2.接種の準備とジャガイモの接種 植物にPVY株N-Wilga(PVYN-Wi;アクセッション番号。EF558545)接種剤(下記参照)注:複数のデジタル顕微鏡が利用可能な場合は、より多くの植物を並行して接種できます。植物は、接種前に少なくとも3枚の完全に発達した葉を持っている必要があります(図1C)。PVYN-Wi は、ジャガイモのcv.ペントランドで乗算され、維持されます。接種のために、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム(DIECA)を添加したリン酸緩衝液を調製します:1.3 mLの0.2 M NaH 2 PO 4、8.7 mLの0.2 M Na2HPO4、および0.225 gのDIECAを混合します。ddH20を使用して容量を100 mLに構成する。1 M NaOH または 1 M HCl 溶液を添加して pH を 7.6 に調整します。 生後6〜8週間のPVYN-Wi に感染したジャガイモのcvを収穫します。組織培養からペントランド植物をフィルターネット(6株あたり0.5g)で抽出バッグに入れ、DIECA(植物材料の4倍の質量、質量:体積比)を添加したリン酸緩衝液を添加します。ハンドホモジナイザーを1〜2分間使用して、均一な溶液を得ます。 生後3〜4週間のジャガイモ植物(ステップ1.6から)の最初の3つの底の完全に発達した葉にカーボランダムパウダーを軽くまぶします。注意: カーボランダムパウダーの量を調整します。多すぎると損傷が発生し、少なすぎると感染が無効になる可能性があります。最適には、0.1 mg/cmのカーボランダム粉末が使用され、これは平均的なサイズ(約15 cm2)の葉あたり約1.5 mgの粉末です。 接種物(葉あたり~100μL)で葉をやさしくこすります。10分後、水道水で葉をよく洗います。葉を傷つけないように注意してください。潜伏時間を超えないようにしてください。葉の大きさに応じて接種量を調整します-6.5μL / cm、これは平均サイズ(約15cm2)の葉あたり約100μLです。 植物を成長チャンバーに移し、制御された環境条件(光で28°C、暗所で28°C、相対湿度55%±5%、放射量250μmol/m2/s、日長16時間)で3日間栽培します。 3. 植物の調製と病変発生の記録のためのデジタルマイクロスコープの使用 接種した植物を、接種後3日後に28°Cに維持した成長チャンバーから22°Cの育成チャンバーに移し、ステップ1.5に記載した他の条件で移す。 観察する植物を選択します。2枚目の接種した葉をテープで固定します(図1D)。イメージングを開始する前に、目的の葉が完全に固定されていることを確認してください(図1D)。 ラップトップコンピュータに画像キャプチャ用のソフトウェアアプリケーションをインストールします。デジタルマイクロスコープをコンピューターに接続します。ソフトウェアを開きます。メモ: 植物、デジタル顕微鏡、およびラップトップが、コンピュータを接続するためのソケットの近くの棚に配置されていることを確認してください。モニターする葉の選択に関する決定は、研究された生物学的問題、例えば、限定的にプログラムされた細胞死の形成につながるプロセスの種類に依存する可能性があります。 固定された葉の上で顕微鏡を調整します。デジタルマイクロスコープのダイヤルを使用してピントを合わせます( 図1Eを参照)。病変の形成を捉える可能性を高めるために、視線ができるだけ広く、病変の外観を見つけるのに十分な大きさであることを確認してください(通常、25倍の倍率が使用されます)。 カメラの設定を行います。画像の右上隅にある[設定]ボタン(図2A、丸で囲んだ部分1)をクリックし、カメラ設定を調整します:明るさ(60-70)、コントラスト(10-15)、色相(0)、ホワイトバランス、彩度(45-50)、シャープネス(0)、ガンマ(5)(図2B)。この調査で使用した設定は、明るさ (64)、コントラスト (14)、色相 (0)、彩度 (47)、シャープネス (0)、ガンマ (5) でした。注意: 最高の画質を確保するために、カメラの設定を外光に合わせて調整する必要があります。設定は、成長チャンバー内のユーザーの条件に応じて調整できます。 Image Capture(画像キャプチャ)のアイコンをクリックして、画像キャプチャ設定を行います(図2C、丸で囲んだ部分2)。[Time-Lapsed Video](タイムラプスビデオ)ボタンをクリックし、15分ごとに24時間画像キャプチャを設定します(図2C)。注:撮影した画像と撮影時間の間の間隔は完全に柔軟であり、実験のニーズに応じて調整できます。撮影の合間には、LEDライトが消灯します。LEDライトは、画像撮影中に自動的に点灯します。 STARTボタンをクリックして、画像キャプチャを開始します(図2C)。注:28°Cから22°Cに移した後、植物は24時間以内に病変を発症し始めるはずです。そうでない場合は、効果のない予防接種の兆候である可能性があります。カーボランダム粉末の量を調整し、葉の接種インキュベーション時間が正しいことを確認し、qPCRによって接種中のウイルス量を測定します。 画像を保存するには、すべての画像を選択し、[ 保存 ]アイコンをクリックします(図2B、丸で囲んだ部分3)。 エクスポート オプションを設定します。DPIを最大(300)に設定します(図2D)。保存後、プログラム内のすべての画像を削除します。 画像解析には、画像を表示/編集するためのプログラムで十分です。画像編集用のフリーソフト「ImageJ」の使い方について、以下で説明します。1 つの視野から画像の時系列をインポートします (左上隅の [ファイル] をクリックし、[ インポート] を選択してから [画像シーケンス] を選択します)。保存した画像のディレクトリのパスを貼り付け、[ OK ]ボタンを押して変換を開始します。 変換後、ソフトウェアは自動的に内部ビデオプレーヤーを開き、最終的なビデオを表示します。[ ファイル]>[名前を付けて保存 ]オプションをクリックし、[ AVI形式]を選択して、ビデオファイルをエクスポートします。小さなウィンドウが開きます。 フレームレート を0.3 fpsに設定し、[ OK ]を押してビデオをAVIビデオファイルとして保存します。注:病変の発生時期は、すべての画像を手動でチェックし、病変が現れる画像を見つけることによっても決定できます。