Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Adrianna Maria Piasek; Iryna Levkovych; Paulina Musolf; Hanna Chmielewska; Aneta &#346;cie&#380;y&#324;ska; Anna Sobiepanek

doi:10.3791/65773

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Biotechnik

Creación de modelos de piel para numerosas aplicaciones, desde el monocultivo bidimensional (2D) hasta el multicultivo tridimensional (3D)

Published: October 20, 2023

doi:

10.3791/65773

Adrianna Maria Piasek*¹, Iryna Levkovych*¹, Paulina Musolf¹, Hanna Chmielewska¹, Aneta Ścieżyńska², Anna Sobiepanek¹

¹Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology, Faculty of Chemistry,Warsaw University of Technology, ²Department of Histology and Embryology,Medical University of Warsaw

Summary

Aquí, presentamos procedimientos económicos y simples para introducir varios modelos de piel en 3D para la investigación de rutina en un laboratorio de cultivo celular. Los investigadores pueden crear modelos adaptados a sus necesidades sin depender de modelos disponibles en el mercado.

Abstract

Debido a la compleja estructura y las importantes funciones de la piel, es un modelo de investigación interesante para las industrias cosmética, farmacéutica y médica. En la Unión Europea, ha habido una prohibición total de probar productos cosméticos y sus ingredientes en animales. En el caso de los medicamentos y productos farmacéuticos, esta posibilidad también está constantemente limitada. De acuerdo con el principio de las 3R, cada vez es más común probar compuestos individuales, así como formulaciones completas en modelos creados artificialmente. Los más baratos y utilizados son los modelos 2D, que consisten en una monocapa celular pero no reflejan las interacciones reales entre las células del tejido. Aunque los modelos 3D disponibles en el mercado proporcionan una mejor representación del tejido, no se utilizan a gran escala. Esto se debe a que son caros, el tiempo de espera es bastante largo y los modelos disponibles suelen limitarse a los que se utilizan habitualmente.

Con el fin de llevar la investigación realizada a un nivel superior, hemos optimizado los procedimientos de varias preparaciones de modelos de piel en 3D. Los procedimientos descritos son baratos y sencillos de preparar, ya que pueden ser aplicados en numerosos laboratorios y por investigadores con diferentes experiencias en cultivo celular.

Introduction

La piel es una estructura continua con interacciones multicelulares que revelan el buen funcionamiento y la homeostasis de este complejo órgano. Está construido a partir de capas morfológicamente diferentes: la capa interna, la dermis, y la capa externa, la epidermis. En la parte superior de la epidermis, distinguimos adicionalmente el estrato córneo (formado por células muertas aplanadas – corneocitos), que proporciona la mayor protección contra el entorno externo. Algunas de las funciones pasivas y activas más importantes de la piel son la protección corporal frente a factores externos, la participación en los procesos inmunológicos, la secreción, la reabsorción, la termorregulación y la detección ^1,2,3. Debido a que se considera uno de los órganos más grandes del cuerpo, es imposible evitar el contacto con diversos patógenos, alérgenos, productos químicos, así como con la radiación ultravioleta (UV). Por lo tanto, está estructurado con muchos tipos de células con funciones específicas. Los principales tipos de células presentes en la epidermis son los queratinocitos (casi el 90% de todas las células, con funciones estructurales e inmunológicas en las partes más profundas de la epidermis, pero que luego se someten al proceso de queratinización para convertirse en corneocitos en la capa superior de la epidermis), los melanocitos (solo el 3%-7% de la población de células epidérmicas, que producen el pigmento protector contra los rayos UV melanina) y las células de Langerhans (del sistema inmunitario). En el caso de la dermis, las células principales son los fibroblastos (productores de factores de crecimiento y proteínas), las células dendríticas y los mastocitos (ambos tipos de células del sistema inmune)^4,5,6. Además, la piel está dotada de varias proteínas extracelulares (como el colágeno tipo I y IV, la fibronectina y la laminina; Figura 1) y fibras proteicas (colágeno y elastina), que aseguran la estructura específica de la piel, pero también estimulan la unión celular, la adhesión celular y otras interacciones⁷.

Figura 1: Esquema que muestra la estructura de la piel. La estructura de la piel marcaba cuatro tipos básicos de células que se encuentran en sus capas individuales y distinguía proteínas de la matriz extracelular. Esta figura fue creada con MS PowerPoint. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La seguridad de los cosméticos y productos farmacéuticos es una cuestión muy importante, y la protección de la salud de los consumidores y pacientes es una prioridad⁸. Hasta hace poco, se suponía que estaba garantizado por numerosas pruebas, incluidos estudios realizados en animales. Desafortunadamente, estos a menudo requerían el uso de métodos drásticos, causando dolor y sufrimiento en animales utilizados con fines de investigación (frecuentemente ratones, ratas y cerdos). En 1959, se introdujeron los Principios de la Técnica Experimental Humanitaria (el principio de las 3R): (1 – Reemplazo) reemplazando a los animales en investigación con modelos in vitro, in silico o ex vivo, (2 – Reducción) reduciendo el número de animales utilizados para la investigación, y (3 – Refinamiento) mejorando el bienestar de los animales que aún son necesarios para la investigación y al mismo tiempo mejorando los métodos alternativos desarrollados⁹. Además, en la Unión Europea (UE), las pruebas estéticas en animales están reguladas por ley. A partir del 11 de septiembre de 2004 entró en vigor la prohibición de los productos cosméticos probados en animales. El 11 de marzo de 2009, la UE prohibió la experimentación con ingredientes cosméticos en animales. No se permitió la venta de productos cosméticos elaborados con nuevos ingredientes probados en animales; Sin embargo, las pruebas de los productos en animales para detectar problemas complejos de salud humana, como la toxicidad por dosis repetidas, la toxicidad reproductiva y la toxicocinética, seguían siendo aceptables. A partir del 11 de marzo de 2013, en la UE, es ilegal vender cosméticos en los que el producto terminado o sus ingredientes hayan sido probados en animales¹⁰. Por lo tanto, actualmente, en cosmetología, la investigación se realiza en tres niveles: in vitro (células), ex vivo (tejidos reales) e in vivo (voluntarios)¹¹. En el caso de los productos farmacéuticos, sigue siendo necesario realizar ensayos con animales; sin embargo, se reduce significativamente y se controla estrictamente¹².

Como métodos alternativos a la experimentación con animales y para la evaluación inicial de la eficacia de un nuevo ingrediente activo, se utilizan los cultivos de células cutáneas in vitro . El aislamiento de diferentes tipos de células de la piel y su cultivo en condiciones de laboratorio estériles permite evaluar la seguridad y la toxicidad de las sustancias activas. Las líneas celulares de piel también son modelos ampliamente reconocidos para la investigación, ya que las células son vendidas por empresas certificadas y los resultados pueden ser comparables en diferentes laboratorios. Estas pruebas generalmente se realizan en modelos 2D simples de monocultivos de células de piel humana. Algunos de los modelos más avanzados son sus cocultivos (como los queratinocitos con fibroblastos y los queratinocitos con melanocitos), así como los modelos tridimensionales, incluidos los cultivos sin andamios (esferas) y los equivalentes cutáneos de la epidermis, la dermis o incluso los sustitutos de espesor completo de la piel¹³. Vale la pena mencionar que, aparte del último tipo (equivalentes de piel), el resto no está disponible comercialmente y, si es necesario, un científico debe prepararlos por su cuenta.

A pesar de que muchos de estos modelos se han mantenido y se venden de forma rutinaria hoy en día (Tabla 1), constantemente se necesitan modelos adicionales para validar la mayoría de los resultados. Por lo tanto, los nuevos modelos de ingeniería deberían recrear mejor las interacciones reales que tienen lugar en el cuerpo humano. Cuando se utiliza una mezcla de células de diferentes tipos para formar dichos modelos, se puede lograr la reproducción del aspecto multicelular del tejido in vivo . Como resultado, se desarrolla un cultivo organotípico (Figura 2).

	Nombre	Descripción
Piel normal	EpiSkin	Epidermis humana reconstruida: queratinocitos en una membrana de colágeno
	SkinEthic RHE	Epidermis humana reconstruida: queratinocitos en una membrana de policarbonato
	SkinEthic RHE-LC	Células de Langerhans modelo epidérmico humano – Queratinocitos y células de Langerhans en una membrana de policarbonato
	SkinEthic RHPE	Epidermis pigmentada humana reconstruida: queratinocitos y melanocitos en una membrana de policarbonato
	Piel en T	Modelo de piel humana reconstruida de espesor completo: queratinocitos en una capa de fibroblastos, que se cultivaron en una membrana de policarbonato
	Modelo Phenion FT Skin	Queratinocitos y fibroblastos en hidrogel
Piel con una enfermedad	Modelo de piel de melanoma FT	Queratinocitos y fibroblastos normales derivados del ser humano con la línea celular A375 de melanoma maligno humano
	Modelo de tejido de psoriasis	Queratinocitos y fibroblastos humanos normales

Tabla 1: Los equivalentes comerciales de piel más populares para varios estudios.

Figura 2: Complejidad de diferentes modelos in vitro . La relación entre la complejidad de diferentes modelos in vitro para recrear un organismo y las interacciones reales que ocurren directamente en el cuerpo humano. La figura ha sido modificada del set “Microbiología y cultivo celular” de Servier Medical Art de Servier (https://smart.servier.com/). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una de las limitaciones más importantes de los equivalentes comerciales es la disponibilidad de modelos de investigación muy generales con unos pocos tipos de células (típicamente 1-2, rara vez 3). Sin embargo, hay muchas más células presentes en la piel, y su interacción entre sí puede garantizar una mejor o peor tolerancia a^{diversos ingredientes}. La falta de algunos componentes inmunitarios puede disminuir su valor en varios tipos de investigación, incluida la inmunoterapia. Se trata de un problema grave, ya que el melanoma es un cáncer de piel potencialmente mortal debido a la aparición precoz de metástasis y a la frecuente resistencia al tratamiento aplicado¹⁵. Para mejorar el modelo de piel artificial, los investigadores intentan establecer un cocultivo de células inmunitarias con líneas celulares y organoides¹⁶ y esto se considera una gran mejora de los modelos estudiados. Por ejemplo, los mastocitos participan en muchos procesos fisiológicos (cicatrización de heridas, remodelación de tejidos) y patológicos (inflamación, angiogénesis y progresión tumoral) en la piel¹⁷. Por lo tanto, su ocurrencia en el modelo puede cambiar significativamente la respuesta del modelo al compuesto estudiado. Finalmente, todavía falta mucha información relacionada con la piel, que solo se puede descubrir realizando una investigación básica. Esta es la razón por la que la creación y el refinamiento de diferentes modelos de piel artificial (Tabla 2) es un esfuerzo tan importante. En este artículo se presentan varios procedimientos para crear modelos de piel avanzados, incluidas esferas y equivalentes de piel.

Modelo de piel in vitro	Intento de recrear las interacciones que ocurren en el tejido	Ejemplos de las células utilizadas
Cultivo celular 2D o 3D	Epidermis	Queratinocitos
		Melanocitos
		Queratinocitos + Melanocitos
	Dermis	Fibroblastos
		Mastocitos
		Fibroblastos + Mastocitos
	Piel	Queratinocitos + Fibroblastos
		Queratinocitos + Mastocitos
		Melanocitos + Fibroblastos
		Melanocitos + Mastocitos
		Queratinocitos + Fibroblastos + Melanocitos
		Queratinocitos + Fibroblastos + Mastocitos

Tabla 2: Ejemplos de mezcla de tipos celulares para recrear tejido cutáneo en cultivo 2D y 3D.

Protocol

El estudio se realizó según las directrices de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Varsovia (KB/7/2022). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio. NOTA: Los procedimientos descritos de la preparación avanzada del modelo de piel se pueden realizar con el uso de células primarias de la piel y líneas celulares disponibles comercialmente o con las células primarias aisladas de los pacientes. Las células comerciales se suministran con los documentos pertinentes, y su uso en investigación para la mayoría de los países no requiere ninguna aprobación adicional. Sin embargo, para algunos países, es obligatorio, por lo tanto, debe verificarse con las regulaciones del Comité de Ética Local. Si las células primarias aisladas de los pacientes deben usarse en la investigación, primero, el estudio debe ser aprobado por el Comité de Ética Local y debe realizarse de acuerdo con sus estrictas pautas. Además, se debe obtener el consentimiento informado por escrito de todos los donantes de tejido cutáneo. El aislamiento de células primarias de la piel no fue el tema de este artículo, pero se pueden encontrar procedimientos de aislamiento ejemplares en Kosten et al. (queratinocitos)18, Ścieżyńska et al. (melanocitos)19, Kröger et al. (fibroblastos y mastocitos)20. La mayoría de las células y líneas celulares normales de la piel tienen un nivel de seguridad de clase BSL1; No causan ninguna amenaza. Sin embargo, el equipo de laboratorio usado debe cumplir con los estándares para el cultivo de células animales y humanas en condiciones controladas. 1. Cultivo de células de la piel NOTA: Los cultivos de células cutáneas deben realizarse en matraces dedicados a células adherentes o en suspensión (según el tipo de célula) a 37 °C y con un contenido de dióxido de carbono del 5% en una incubadora. Las actividades relacionadas con su cultivo y uso para la investigación requieren condiciones estériles y deben realizarse en una cámara laminar después de la exposición a los rayos ultravioleta C (UVC) durante 15-30 min. La obtención de suspensiones celulares, que luego se utilizan para crear los modelos bidimensionales y tridimensionales, requiere la implementación de procedimientos según el tipo de célula (para células adherentes como queratinocitos, fibroblastos y melanocitos – paso 1.1, para células no adherentes de mastocitos – paso 1.2) (Figura 3). Para diferentes tamaños de matraces de cultivo, los volúmenes de todos los reactivos (como medio, solución salina tamponada con fosfato o solución de tripsina) utilizados en los métodos descritos se enumeran en la Tabla 3. Los parámetros que dependen del tipo de celdas (por ejemplo, concentración y composición de reactivos, método de centrifugación, etc.) se clasifican en la Tabla 4. Las densidades de celdas utilizadas para la siembra se muestran en la Tabla 5. Todas estas tablas se incluyen al final de esta sección. Figura 3: Cultivo de células adherentes y no adherentes. El procedimiento general paso a paso del cultivo de células adherentes y no adherentes (los números corresponden a las descripciones de los pasos 1.1 y 1.2). La figura fue creada con MS PowerPoint. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Obtención de una suspensión de células adherentesRetire el medio del matraz de cultivo. Lave suavemente las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Tabla 3). Añadir solución de tripsina en ácido etilendiamina tetraacético (solución de tripsina-EDTA, Tabla 3). Incubar el matraz a 37 °C y controlar el desprendimiento de células de la superficie en el microscopio óptico. Suspender las células desprendidas en al menos una cantidad doble de medio de crecimiento completo o neutralizador de tripsina para desactivar la tripsina (2:1) (para los volúmenes, consulte la Tabla 3, y para los reactivos, consulte la Tabla 4). Transfiera cuantitativamente el contenido del matraz al tubo de 15 mL. Tome un pequeño volumen (20 μL) de suspensión celular en un tubo de 1.5 mL y cuente las células con un hemocitómetro manual o automático. Centrifugar el tubo (parámetros en la Tabla 4), eliminar la mayor parte del sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en la pequeña cantidad del líquido restante. Luego, agregue suficiente medio fresco para obtener el volumen de precentrifugación (volumen en la Tabla 3) si la densidad celular es apropiada para sembrar o recalcule el volumen requerido del nuevo medio.NOTA: Algunas células, como los melanocitos, son muy sensibles a la centrifugación, por lo que evitan la necesidad de volver a centrifugarlas en una distancia de tiempo corta. Prepare la suspensión celular de la densidad requerida (células/mL, densidad celular en la Tabla 5) para el experimento (mono o multicultivos 2D/3D de células de la piel).NOTA: Si se van a seguir cultivando células, se deben devolver 5.000-8.000 células/ml a un matraz nuevo y añadir medio fresco (volumen en el Cuadro 3). Obtención de una suspensión de células no adherentesRetire el medio con la suspensión celular del matraz de cultivo y transfiéralo cuantitativamente al tubo de 15 mL. Tome un pequeño volumen (20 μL) de la suspensión celular en un nuevo tubo de 1,5 mL. Cuente las células con un hemocitómetro manual o automático. Centrifugar el tubo (parámetros en la Tabla 4), eliminar la mayor parte del sobrenadante y volver a suspender las células en una pequeña cantidad del líquido restante. A continuación, agregue medio fresco para obtener el volumen de precentrifugación (como se indica en la Tabla 3) si la densidad celular es adecuada para sembrar o recalcular el volumen requerido del nuevo medio. Prepare la suspensión celular de la densidad requerida (células por mL, como se sugiere en la Tabla 5) para el experimento (mono o multicultivos 2D/3D de células de la piel).NOTA: Si las células se van a cultivar más profundamente, devuelva 5.000-8.000 células/ml a un matraz nuevo y agregue medio fresco. 25 cm2 matraces de cultivo 75 cm2 matraces de cultivo Medio de cultivo [mL] 4–5 8–12 PBS [mL] 5 10 Tripsina-EDTA [mL] 0.5–1 1–2 Medio de neutralización [mL] 1–2 2–4 Tabla 3: Volúmenes de reactivos utilizados durante el cultivo y preparación de suspensiones celulares. Monocultivo de células de la piel Tripsina Desactivador de tripsina Centrifugación Tipo medio para monocultivo 2D Queratinocitos 0.25% con neutralizador de tripsina 300 x g, 5 min, RT Medio de crecimiento de queratinocitos 2 Fibroblastos 0.25% con medio 300 x g, 5 min, RT DMEM, 10% FBS Melanocitos 0.025% con neutralizador de tripsina 300 x g, 3 min, RT Medium 254, Suplemento de crecimiento de melanocitos humanos sin PMA-2 Mastocitos No es necesario No es necesario 300 x g, 3 min, RT IMDM, 10% FBS, 1% aminoácidos no esenciales, 226 μM α-monotioglicerol Tabla 4: La tripsinización, los parámetros de centrifugación y el tipo de medio dependen del tipo de célula. Tipo de modelo Densidad celular [célula/mL] 2D Monocapa Fibroblastos 2 x 105 Mastocitos Queratinocitos Melanocitos 3D Esfera (método de caída colgante) Fibroblastos 5 x 105 Mastocitos Queratinocitos Melanocitos Mezcla de células Esfera (método de adhesión celular limitante) Fibroblastos 2 x 105 Mastocitos Queratinocitos Melanocitos Mezcla de células Equivalente Fibroblastos 1 x 105 Mastocitos 1 x 104 Queratinocitos 8 x 105 Melanocitos 5 x 104 Tabla 5: Densidad de siembra celular para diferentes tipos de modelos de piel. 2. Preparación de las esferas celulares de la piel NOTA: Para crear esferas, el uso del método de caída colgante se describe en el paso 2.1 (Figura 4), mientras que el enfoque centrado en limitar la adhesión de las células se muestra en el paso 2.2 (Figura 5). Sin embargo, como las esferas son muy pequeñas y pueden ser inestables, las actividades realizadas bajo estos métodos requieren paciencia, delicadeza y acciones lentas. El método de la caída colganteUtilice una densidad de células adecuada para lograr el tamaño de esfera deseado (densidad de células recomendada 5 x 105 células/mL, Tabla 5). Pipetear 20 μL de la suspensión celular en la tapa de una placa de Petri o una placa de pocillos múltiples (Figura 4A). Cubra el plato/plato con la parte inferior y gírelo suavemente (se crearán automáticamente gotas colgantes en las tapas, Figura 4B). Llene la placa de Petri/los pocillos de la placa con una solución estéril de agua/PBS para evitar la evaporación del medio por gotas. Incubar las gotas durante 48-72 h a 37 °C.NOTA: La gravedad tira de las células hacia abajo, y la falta de superficie accesible impide la unión de las células al vaso y promueve la agregación celular. Sin embargo, algunos tipos de células pueden requerir una incubación más larga. Antes de realizar el siguiente paso, llene los pocillos de la nueva placa (o use la placa vieja con agua extraída/PBS de los pocillos) con el medio de crecimiento completo (100 μL).NOTA: Antes del siguiente paso, tome puntas de 200 μL, retire 1/5 de cada extremo de la punta y esterilice antes de usar. Transfiera las esferas de celdas a los pocillos de la placa de pocillos múltiples utilizando puntas de pipeta estériles con un extremo cortado. Tome puntas de 200 μL, retire 1/5 de cada extremo de la punta y esterilícelas antes de usar (Figura 4C).NOTA: Este paso puede ser difícil, ya que el flujo de líquido durante el volteo del plato/plato puede dañar las esferas. Incubar las esferas transferidas durante 1 día en la placa de pocillos múltiples a 37 °C antes de realizar cualquier otro experimento (por ejemplo, adición de compuestos, ensayos de citotoxicidad, introducción de esferas a equivalentes) (Figura 4D). El método para limitar la adhesión celularAntes de la siembra de la célula, cubra los pocillos de la placa inferior en U con una solución de surfactante (por ejemplo, Pluronic F-127, polietilenglicol, alcohol polivinílico)21. Prepare y agregue 100 μL de solución de surfactante al 1% en PBS en cada pocillo. Incubar la placa con la solución durante 24 h a 37 °C (Figura 5A-C). Almacene la placa por más tiempo si es necesario, pero mantenga el nivel de líquido agregando más tampón PBS. Prepare la suspensión celular en la densidad celular deseada en 50 μL por pocillo (densidad celular recomendada durante la siembra 2 x 105/mL, Tabla 5). Retire la solución de surfactante de los pocillos antes de sembrar las células para evitar la ruptura de la membrana celular por lisis (Figura 5D). Añadir la solución celular a la placa e incubar durante 24 h a 37 °C para alcanzar los agregados celulares (Figura 5E). Después de aproximadamente 1-3 días, se formarán esferas (Figura 5F) y estarán listas para usar en cualquier experimento posterior. Figura 4: El método de la gota colgante. (A) pipetear la suspensión de la célula en la tapa y cubrir la tapa con la parte inferior del plato; (B) girar el plato para crear las gotas colgantes; (C) adición de agua/PBS a la parte inferior del plato (limitando la evaporación del líquido); (D) incubación de los platos con gotas colgantes para crear esferas celulares; (E) recolección de gotas con esferas formadas y estabilización de esferas transferidas en placas de pocillos múltiples. La figura fue creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Preparación paso a paso de las esferas mediante el método de adhesión de la célula limitante. (A) Pozo de fondo en U; (B,C) limitación de la adhesión celular por solución de surfactante; (D) remover la solución de los pozos; E) células de siembra; (F) agregación de células y formación de una esfera. La figura fue creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Preparación de equivalentes cutáneos de espesor completo NOTA: El desarrollo de los equivalentes cutáneos de espesor completo (epidermis y dermis) se puede dividir en tres pasos (Figura 6): la preparación de la capa de dermis artificial con la aparición de células dérmicas típicas (como fibroblastos y mastocitos, Figura 6A), siembra de células incluidas en la epidermis artificial (principalmente queratinocitos y melanocitos, Figura 6B) y crecimiento vertical de queratinocitos con un posible proceso de queratinización (formación del estrato córneo, Figura 6C). La preparación de equivalentes de piel de espesor completo se describe en el paso 3.1 (3.1.1-3.1.10). Si se necesita un equivalente de piel menos avanzado (por ejemplo, solo el tipo de epidermis), el tipo de célula seleccionado (como los queratinocitos) se puede sembrar directamente en las membranas de colágeno o policarbonato disponibles comercialmente y también cultivarse con la posibilidad de inducir el proceso de queratinización (pasar directamente a los pasos 3.1.9-3.1.10). Figura 6: Preparación paso a paso de equivalentes de piel de espesor completo en insertos. (A) preparación de la capa de pseudo-dermis con células dérmicas, (B) siembra de células epidérmicas, (C) cultivo adicional de equivalente en medio, (D) cultivo de interfaz aire-líquido promueve la formación de epitelio estratificado. La figura fue creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparación de equivalentes de piel de espesor completo en una placa de 24 pocillosColoque los tubos con agua, PBS (10x), NaOH 1 M y solución de colágeno tipo I en hielo. Determine un número adecuado de células dérmicas (por ejemplo, fibroblastos y mastocitos; en una proporción de 10:1) que se sembrarán en el hidrogel. Transfiera un número adecuado de células dérmicas a un tubo de 1,5 mL (500 μL de fibroblastos y 500 μL de mastocitos, de acuerdo con las densidades celulares de la Tabla 5) y centrifugue las células (300 x g, 3 min, RT). Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células en la mezcla de 695 μL de agua/100 μL de PBS (10x)/5 μL de NaOH.NOTA: Si 1 mL de la solución total no es suficiente, utilice la Tabla 6 para volver a calcular los volúmenes de cada reactivo. Agregue 200 μL de solución de colágeno a la mezcla y mezcle suavemente mediante pipeteo.NOTA: Tenga cuidado, ya que la consistencia de la mezcla será densa. Agregue 200 μL de la mezcla preparada al inserto en una placa de 24 pocillos. Para un modelo sin el estrato córneo, agregue 500 μL a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) y luego transfiérala a la incubadora durante 30 minutos.NOTA: Compruebe si el hidrogel se ha polimerizado antes de cualquier otra acción. Antes de la siembra de células en la superficie del hidrogel, enjuáguelo con un tampón PBS (500 μL/pocillo). Determine el número adecuado de células epidérmicas (por ejemplo, queratinocitos y melanocitos; en una proporción de 15:1) que se sembrarán sobre el hidrogel. Prepare la mezcla celular en 500 μL del medio DMEM suplementado con 10% de FBS (agregue 250 μL de queratinocitos y 250 μL de melanocitos, las densidades celulares se mencionan en la Tabla 4) y agregue suavemente a los pocillos.NOTA: En algunos casos, es mejor sembrar primero los melanocitos y dejar que se esparzan bien en el hidrogel, y después de 24 h adicionales, eliminar el medio y sembrar los queratinocitos. En ese caso, agregue 250 μL de suspensión celular y 250 μL del medio. Incubar las placas a 37 °C durante 2-5 días, dependiendo de la velocidad de crecimiento celular, con intercambio de medios (con una concentración decreciente de FBS del 10% al 1%) cada 48 h y seguimiento celular realizado en el microscopio óptico. Si se va a inducir el proceso de queratinización después de obtener una monocapa de queratinocitos sobre el hidrogel, utilice el medio libre de FBS complementado con iones de calcio y ácido L-ascórbico durante 2-7 semanas adicionales (en la concentración de 1,5 μM de CaCl2 y 50 μg/mL de ácido L-ascórbico).NOTA: El tiempo de incubación depende de los queratinocitos utilizados y de su velocidad de diferenciación. Reactivo La ecuación para calcular el volumen de un reactivo Ejemplos de cálculos (para un volumen final = Vtotal de 1 mL) solución de colágeno tipo I (Colágeno C = 10 mg/mL) 0,2 ml = 200 μl PBS (10x) 0,1 ml = 100 μl 1 M de NaOH 0,005 ml = 5 μl estéril H2O 0,695 ml = 695 μl Tabla 6: Cálculo de los volúmenes de reactivos necesarios para la preparación de hidrogel de colágeno tipo I de 2 mg/mL. 4. Identificación de tipos celulares en un modelo de piel 3D mediante métodos de tinción celular NOTA: Para confirmar que el modelo de piel desarrollado consta de las células esperadas, es bueno realizar una tinción celular. Es un paso crucial antes de que se pueda realizar cualquier experimento objetivo en un modelo dado22. En el caso de los modelos de piel en 3D, es necesario incrustar un modelo determinado en parafina y preparar portaobjetos microscópicos con el tejido artificial cortado en un micrótomo (paso 4.1) antes de la tinción celular (Figura 7). Figura 7: Pasos básicos de la incrustación de un modelo de piel en 3D, tinción celular y observaciones microscópicas. La figura fue creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Incrustación de modelos de piel en 3DLave la piel equivalente con PBS durante 5 min a RT dos veces y fíjela con una solución de paraformaldehído al 3,7% en PBS (30 min, RT). Repita el paso de lavado con PBS. Antes de incrustar, deshidrate el equivalente de la piel incubando en concentraciones crecientes de soluciones de etanol: 50% (15 min), 70% (15 min), 96% (2x, 30 min) y 99,8% (2x, 30 min). Poner el equivalente de piel fija y deshidratada en el molde lleno de parafina.NOTA: Coloque el equivalente en una orientación adecuada. Cubre el molde con el casete y añade más parafina por encima. Deje que se solidifique hasta por 30 minutos en RT. Congele el equivalente de piel incrustado en parafina durante al menos 1 h a -80 °C. Encienda el micrótomo, inserte el equivalente de piel incrustado en parafina y corte rodajas de 5 μm. Coloque las láminas de tejido artificial cortadas en los portaobjetos microscópicos y séquelos durante al menos 8 h a 37 °C. Sumerja los portaobjetos en xileno (2 veces, 10 minutos) y, a continuación, rehidrate los portaobjetos con las concentraciones decrecientes de etanol del 99,8 % (5 minutos), 96 % (5 minutos), 70 % (5 minutos) y 50 % (5 minutos). Retire los portaobjetos de la solución de etanol y enjuáguelos dos veces con agua (5 min).NOTA: La tinción celular tradicional se realiza mediante la aplicación de colorantes específicos (hematoxilina, eosina23) o mediante el uso de anticuerpos dirigidos selectivamente a biomarcadores (incluyendo colágeno 1A2 para fibroblastos, citoqueratina 14 para queratinocitos, melan-A o tirosinasa para melanocitos24). Se puede realizar una tinción rutinaria de hematoxilina y eosina siguiendo los protocolos elaborados por diferentes empresas (paso 4.2). Por otro lado, si se requiere tinción inmunofluorescente o inmunohistoquímica, el procedimiento es diferente y significativamente más largo (pasos 4.3 y 4.4). Para evitar reacciones inespecíficas, utilice los anticuerpos primarios producidos en diferentes especies y, a continuación, los anticuerpos secundarios específicos. Tinción de hematoxilina y eosina en modelos de piel en 3DTiñir el portaobjetos microscópico en solución de hematoxilina durante 3 min a RT. Lave los portaobjetos en una solución de alcohol acidificado durante 1 min.NOTA: Prepare la solución de alcohol acidificado mezclando 2 mL de ácido clorhídrico al 35%-38% con 98 mL de alcohol etílico al 99,8%. A continuación, lave el portaobjetos en una solución de bicarbonato de sodio al 0,1% para obtener un color azul-violeta visible y delicado.NOTA: Para obtener una solución de bicarbonato de sodio al 0,1%, disuelva 100 mg de bicarbonato de sodio en 100 mL de agua ultrapura. Lave los portaobjetos con etanol al 95% durante 1 min. Tiñir el portaobjetos microscópico en una solución de eosina durante 1 min a RT. Lave los portaobjetos con etanol al 95% durante 1 min y etanol al 99,8% durante 2 min. Lave los portaobjetos con xileno durante 2 minutos cada uno dos veces. Móntelo en bálsamo y coloque un cubreobjetos en la parte superior del tobogán. Las muestras están listas para observaciones microscópicas. Tinción inmunofluorescente de modelos de piel en 3DEnjuague el portaobjetos con PBS (5 min). Preparar la solución de bloqueo (albúmina sérica bovina [BSA] al 3% o leche descremada en un tampón PBS con la adición de 0,1% de Triton X-100 y 0,1% de Tween 20) e incubar el portaobjetos en ella durante 1 h a RT. Lave los portaobjetos dos veces con un tampón PBS (5 min). Diluir el anticuerpo primario en el tampón PBS (de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, Tabla 7) e incubar los portaobjetos durante 1-2 h a RT o toda la noche a 4 °C. Lave los portaobjetos dos veces con un tampón PBS (5 min). Diluir el anticuerpo secundario en el tampón PBS (según las recomendaciones del fabricante, Tabla 7) e incubar los portaobjetos durante 1 h en RT. Lave los portaobjetos dos veces con PBS (5 min). Prepare la solución de colorante para la tinción de núcleos (p. ej., Hoechst 33342 o DAPI, Tabla 7) e incube los portaobjetos durante un máximo de 15 minutos en RT. Lave los portaobjetos con PBS (5 min). Móntelo en bálsamo, cubra la sección con un cubreobjetos y visualice los efectos de la tinción celular con un microscopio fluorescente. Tinción inmunohistoquímica de modelos de piel en 3DRealice los pasos 4.3.1-4.3.5. Además, realice una etapa de lavado con un tampón apropiado para la enzima con la que se conjuga el anticuerpo secundario. Diluir el anticuerpo secundario en un tampón adecuado para la enzima conjugada (según las recomendaciones del fabricante) e incubar los portaobjetos durante 1 h a RT. Lave los portaobjetos dos veces con PBS (5 min). Prepare la solución de un sustrato adecuado para la enzima utilizada e incube los portaobjetos de acuerdo con las recomendaciones del productor. Lave los portaobjetos con un tampón (5 min) y móntelos en bálsamo. Visualice los efectos de la tinción celular mediante microscopía de campo claro. Tipo de célula/organoide celular detectado Agente tintante Dilución / Concentración Mastocitos Avidina-Sulforhodamina 101 1 μg/mL Fibroblastos Anticuerpo Col1A2 producido en conejo 1:50 Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con FITC 1:250 Queratinocitos Anticuerpo contra la citoqueratina 14 producido en ratón 1:50 Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con FITC 1:250 Melanocitos Anticuerpo Melan-A producido en ratón 1:50 Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con FITC 1:250 Núcleos Hoechst 33342 1 μg/mL DAPI 1 μg/mL Tabla 7: Concentraciones y diluciones de los reactivos utilizados para la tinción celular.

Representative Results

Antes de comenzar a crear modelos de piel en el laboratorio, se debe tomar una decisión sobre el tipo de células que se utilizarán (primarias/línea celular) y la selección de un medio adecuado para estas células. La mayoría de los bancos de células recomiendan y pueden proporcionar medios para todo tipo de cultivo celular. En el caso de un modelo multicultivo, es necesario seleccionar un medio que se adapte a todos los tipos de células presentes en el cultivo. En la Tabla 8 18,19,20,25,26,27 se recogieron algunos medios celulares típicos utilizados tanto para el cultivo primario de células cutáneas como para las líneas celulares cutáneas más comunes. Los medios típicos utilizados para los cultivos celulares primarios son bastante caros y su composición es compleja. Por otro lado, las líneas celulares suelen estar satisfechas con medios con una composición simple. Algunos tipos celulares (principalmente fibroblastos y mastocitos) pueden producir y secretar factores que estimulan el crecimiento de otras células (como queratinocitos y melanocitos)28,29. Si se planea su presencia en un modelo, no es necesaria una suplementación adicional del medio. Tipo de célula Nombre de la celda Medio Referencia Queratinocitos Línea de celda HaCaT DMEM, 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina Según el vendedor Queratinocitos epidérmicos humanos normales primarios (NHEK) Medio de crecimiento de queratinocitos 2 (medio basal + mezcla de suplementos) Según el vendedor Queratinocitos epidérmicos humanos primarios; Normal, Adulto (HEKa) Medio basal de células dérmicas, 0,4% de extracto de hipófisis bovina, 0,5 ng/mL de factor de crecimiento transformante rh-alfa, 6 mM de L-glutamina, 100 ng/mL de hidrocortisona Hemisuccinato, 5 mg/mL de insulina rh, 1 mM de epinefrina, 5 mg/mL de Apo-Transferrina, 100 U/mL de penicilina (si es necesario), 100 μg/mL de estreptomicina (si es necesario) Según el vendedor Queratinocitos primarios DMEM/F-12 (3:1), 1 % de ultroser G, 1 μM de hidrocortisona, 1 μM de isoproterenol, 0,1 μM de insulina, 1 ng/ml de factor de crecimiento de queratinocitos, 1 % de penicilina-estreptomicina 18 Melanocitos Melanocitos primarios Medium 254, Suplemento de crecimiento de melanocitos humanos sin PMA-2, solución antibiótica al 1% 19 Melanocitos primarios RPMI-1640, 10% FBS, 14,7 μg/mL solución de rojo de fenol, 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina 27 Línea celular HEMa-LP Medio 254, 5 μg/mL de insulina rh, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 6 mM de L-glutamina, 1 μM de epinefrina, 1,5 mM de cloruro de calcio, 100 U/mL de penicilina (si es necesario), 100 μg/mL de estreptomicina (si es necesario) Según el vendedor Melanocitos epidérmicos humanos normales primarios (NHEM) Medio de crecimiento de melanocitos (medio basal + mezcla de suplementos) Según el vendedor Fibroblastos Fibroblastos de espiga humana primaria (HTF) EMEM, 5 % de FBS, 5 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos rh, 5 μg/mL de insulina rh, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 7 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B 28 HTFs primarios, y DMEM, 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B 20.28 Fibroblastos dérmicos humanos primarios Línea celular HFF-1 DMEM, 15% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina Según el vendedor Línea celular BJ EMEM, 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina Según el vendedor Mastocitos mastocitos primarios de la piel humana (hsMCs) IMDM, 10% FBS, 1% aminoácidos no esenciales, 226 μM α-monotioglicerol, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina 20 Línea celular LAD2 StemPro-34, Suplemento nutricional StemPro-34 al 2,5%, 2 mM de L-glutamina, 100 ng/mL de factor de células madre rh, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina 29 Líneas celulares HMC-1.1 y 1.2 IMDM, 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 25 mM HEPES, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina 29 Tabla 8: Resumen de los medios más utilizados para el cultivo de células primarias de la piel y líneas celulares.Leyenda: Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM), Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM), Suero Fetal Bovino (FBS), Mezcla de Nutrientes Ham’s F-12 (F12), Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM), humano recombinante (rh), Roswell Park Memorial Institute (RPMI). En este artículo, se crearon modelos de piel con las células primarias de queratinocitos, melanocitos, fibroblastos y mastocitos. Son ligeramente más exigentes que las líneas celulares, y los medios recomendados para su cultivo, que se utilizaron para el cultivo de una sola célula, son: Keratinocyte Growth Medium 2 suplementado (para queratinocitos), Medium 254 suplementado (para melanocitos), medio DMEM suplementado (para fibroblastos) y medio IMDM suplementado (para mastocitos). En estos medios, las células presentan su morfología típica asignada a su tipo (en la Figura 8 se muestran imágenes representativas). En el caso de multicultivos de dos o más tipos de células, era importante elegir un medio en el que pudieran crecer todos los tipos de células cultivadas. Después de algunas pruebas, se seleccionó un medio DMEM con un 10% de FBS y una mezcla de antibióticos al 1% para preparar los modelos 3D más avanzados de esferas y equivalentes. Figura 8: Las células de la piel presentan una morfología diferente a la observada durante el monocultivo 2D. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Las esferas (comúnmente llamadas esferoides) son uno de los modelos 3D más simples desarrollados por investigadores de ingeniería celular y de tejidos, aunque las esferas creadas a partir de células de la piel no son tan populares. Dentro de este modelo, es posible la creación de esferas mono y multiculturales. En la literatura se han descrito múltiples métodos para la preparación de esferas (por ejemplo, con una gota colgante, limitación de la adhesión celular, levitación magnética, rotación, microfluídica, etc.)30. Debido a la facilidad de preparación, el bajo costo y los materiales fácilmente disponibles, así como el equipo, se recomiendan los dos primeros métodos para los principiantes en modelos de celdas tridimensionales (3D) y los protocolos para su rendimiento se pueden encontrar más arriba (paso 2.1 y 2.2). De acuerdo con la literatura31,32, los parámetros más importantes en estos métodos son el número de células, el volumen de la suspensión celular y el tiempo de incubación. Las esferas se pueden crear con diferentes números de células, pero la densidad de células para la siembra debe optimizarse para cada tipo de célula por separado, así como para los cocultivos de células. El proceso de optimización llevado a cabo para monocultivos de queratinocitos y fibroblastos reveló que la siembra de 1 x 104 células por pocillo proporcionó los mejores resultados para ambos tipos de células. Las esferas presentadas en la Figura 9 se prepararon utilizando el método de limitación de la adhesión celular en las placas inferiores en U (paso 2.2). Se aconseja preparar al menos 4 pocillos con repeticiones técnicas (lo óptimo es 6 pocillos). Las esferas que constaban de 1 x 104 celdas eran más fáciles de manipular, ya que eran visibles en los pozos. Como consecuencia, incluso fue posible eliminar el medio antiguo de los pozos durante los ensayos sin drenar las esferas. Después de las operaciones descritas, las formas de las esferas se mantuvieron en su mayoría sin cambios y repetibles. La estabilidad de las esferas más grandes fue baja durante el proceso. También vale la pena mencionar que diferentes tipos de células pueden formar esferas de diferentes colores (por ejemplo, los queratinocitos forman esferas más oscuras, mientras que las esferas de fibroblastos son significativamente más claras). Figura 9: Creación de esferas. Esferas creadas por diferentes tipos y números de células de la piel con el uso del método de adhesión de células limitantes. Barras de escala (panel superior): 200 μm. Barras de escala (panel inferior): 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Como se mencionó en el método de caída colgante (paso 2.1), en cierto punto, las esferas requieren ser transferidas de la tapa al pozo. Este proceso puede ser potencialmente dañino para las esferas. Por lo tanto, para este paso, es esencial una alta precisión de trabajo. Las esferas creadas son propensas a perder la forma adecuada si no se manejan con cuidado (Figura 10). La primera imagen (Figura 10A) presenta una buena esfera igualmente redondeada en todos los lados. En la segunda y tercera imagen (Figura 10B,C) se observó una leve pérdida de forma por parte de la esfera, pero el agregado celular permanece redondeado. Las últimas tres imágenes (Figura 10D-F) muestran diferentes fases de daño esférico. Es necesario adquirir experiencia para obtener la repetibilidad de las formas y estructuras de esferas creadas. Con los primeros intentos de desarrollo de las esferas, se recomienda utilizar el método de limitación de la adhesión celular para investigadores inexpertos (paso 2.2), ya que proporciona resultados más comparables con la influencia limitada de la actividad del investigador. Figura 10: Posibles dificultades en la transferencia de esferas de la tapa al pozo: el método de la gota colgante. (A) una buena esfera, (B,C) esferas ligeramente dañadas, (D-F) esferas muy dañadas. Las imágenes fueron tomadas 24 h después del traslado. Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los equivalentes son modelos 3D mucho más avanzados de piel artificial que esferas. Durante el proceso de construcción de un modelo de piel, se deben considerar varios aspectos, incluyendo el número de capas en el modelo (solo epidermis, solo dermis, dermis con epidermis y estrato córneo), tipos de células utilizadas, materiales aplicados, tamaño preferible del equivalente, tipo de investigación en la que se utilizará posteriormente, etc.14. Los equivalentes de piel se pueden colocar en insertos especiales colocados en las placas estándar de pocillos múltiples del tamaño deseado (96, 48, 24 pocillos, etc.). A pesar de que los insertos son más fáciles de transferir de un pozo a otro y durante el intercambio de medios, el equivalente no se puede dañar; Son bastante caros. Si el modelo no requiere la presencia del estrato córneo, una solución más barata es preparar el equivalente en un pocillo de la placa multipocillo. La capa de dermis artificial se construye típicamente como un modelo basado en andamios mediante el uso de hidrogeles naturales (gelatina, colágeno, fibrina, ácido hialurónico, quitosano-alginato, etc.) o sintéticos (polietilenglicol, diacrilato y ácido poliláctico)33. Para ser similar a la dermis de la piel real, esta capa debe contener principalmente agua con algunos componentes de la matriz extracelular (MEC) (incluido el colágeno o la fibronectina), que median la unión celular, las interacciones célula-célula y otras accionescelulares 34. En esta investigación, se seleccionó el colágeno tipo I porque es fácil de preparar en forma de hidrogel, y su estructura flexible garantiza la facilidad de futuras actividades de investigación potenciales (por ejemplo, la transferencia del equivalente de un plato a otro). La solución de colágeno tipo I obtenida de la cola de rata se prepara normalmente por disolución de polvo en ácido acético 20 mM. Para lograr el paso de polimerización del colágeno, es necesario proporcionar condiciones de pH adecuadas que oscilen entre 6,5 y 7,5. Esto se puede asegurar mediante la adición de una cantidad estricta de hidróxido de sodio. Para mayor facilidad, algunas empresas han introducido cálculos específicos, que pueden ayudar a determinar los volúmenes exactos necesarios para preparar dichos hidrogeles (Tabla 6). Aunque en la literatura se pueden encontrar diferentes concentraciones de colágeno en los hidrogeles (por ejemplo, 0,5-2 mg/mL35; 5-30 mg/mL36; bajo y alto contenido de colágeno37), en el modelo descrito se utilizó la solución de 2 mg/mL ya que el hidrogel todavía tenía una estructura flexible, pero era lo suficientemente compacto como para ser sacado del pozo si era necesario. Para preparar una piel de espesor completo bastante realista, se deben sembrar células equivalentes en la proporción posiblemente más cercana a esta presente en nuestro cuerpo. En el caso de la epidermis, dependiendo del sitio del cuerpo, la relación entre un melanocito y un conjunto de queratinocitos asociados es de aproximadamente 1:36, que se define como la Unidad Epidérmica de Melanina (UEM)38. Así, la proporción aplicada en la epidermis artificial fue de 1 melanocito por 15 queratinocitos (Tabla 5). Para crear una capa de dermis artificial, se utilizó el hidrogel de colágeno tipo 1 en el que se incorporaron fibroblastos y mastocitos en la proporción de 1 mastocitos por cada 10 fibroblastos. Cada capa del equivalente construido puede ser monitoreada en tiempo real en el microscopio óptico invertido cambiando la profundidad de la muestra observada (se muestran imágenes ejemplares en la Figura 11). Figura 11: Observación en tiempo real de diferentes células en capas particulares del equivalente de piel de espesor completo creado. (A) pseudodermis y (B) pseudoepidermis) visualizados por la microscopía de campo claro. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Se pueden realizar observaciones más precisas con la confirmación de la obtención de la estructura prevista del modelo realizando la tinción del equivalente. El equivalente fijo debe incrustarse primero en parafina y luego cortarse en un micrótomo. Los portaobjetos con tejido artificial fino se pueden teñir posteriormente con diferentes colorantes, entre ellos hematoxilina y eosina (tinción básica que se realiza en laboratorios médicos). Gracias a esta acción, es posible distinguir la dermis y la epidermis artificiales en sus equivalentes, así como identificar las células individuales de la piel (Figura 12). En la Figura 12 no solo se muestran los tipos celulares específicos, sino que también es posible ver los queratinocitos en diferentes fases del proceso de división celular (telofase y metafase). En el caso de los mastocitos, los gránulos específicos son bien reconocibles dentro de la célula. Estas imágenes confirman inicialmente que el equivalente de piel creado está vivo (las células están creciendo en él) y que son capaces de funcionar normalmente en el modelo desarrollado. Sin embargo, con la epidermis en 3D y los modelos de espesor completo de la piel, es especialmente importante comprobar la calidad y la funcionalidad de la construcción obtenida. Para verificar la permeabilidad del estrato córneo se deben aplicar las medidas de Resistencia Eléctrica Transepitelial (TEER) o tinción con Amarillo Lucifer39,40. Además, en una piel artificial adecuadamente compuesta, deben estar presentes marcadores específicos, incluidos marcadores de diferenciación (p. ej., filagrina, involucrina, loricrina, queratina 10, queratina 5, clases de lípidos que comprenden ceramidas), marcadores de unión dermo-epidérmica (p. ej., colágeno tipo IV, laminina V, alfa6Beta4-integrina, antígeno BP)41, marcadores de unión estrecha en las capas epidérmicas (p. ej., claudina-1, ocludina, proteína zonula occludens (ZO)-1)42 así como marcadores de proliferación de la capa basal (Ki67)41. Figura 12: Morfología y funcionamiento de las células de la piel. Visión general de la morfología y el funcionamiento de las células cutáneas (observación de las divisiones celulares) en el equivalente cutáneo de espesor completo teñido con hematoxilina y eosina. Barras de escala: 100 μm (panel superior), 50 μm (panel central, izquierda), 100 μm (panel central, derecha), 50 μm (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La forma más utilizada para confirmar la presencia de un biomarcador es mediante la realización de tinciones específicas, como inmunohistoquímica o inmunofluorescente. Se pueden aplicar diferentes anticuerpos y tintes fluorescentes para la visualización microscópica de células particulares en los modelos. El resultado de una tinción ejemplar de células en cultivo se puede ver en la Figura 13. Para observar los queratinocitos se utilizó un anticuerpo contra la citoqueratina 14. En el caso de los melanocitos, fue el anticuerpo específico de melan-A. El anticuerpo colágeno 1A2 se utilizó para teñir fibroblastos y la sulfododamina 101 fluorescente conjugada con avidina detectó heparina presente en los mastocitos. Figura 13: Resultados de la tinción con células fluorescentes. (A) Citoqueratina 14 en queratinocitos. Barra de escala: 50 μm. (B) Melan-A en melanocitos. Barra de escala: 50 μm. (C) Colágeno 1A2 en fibroblastos. Barra de escala: 100 μm. (D) Heparina en mastocitos. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este artículo presenta la metodología que se puede aplicar para preparar los propios modelos avanzados de piel artificial. Es una buena solución cuando la investigación planificada requiere modelos de investigación estrictamente definidos que pueden resultar no disponibles en el mercado o muy costosos. Como se mencionó anteriormente, hay varios equivalentes comerciales de la piel disponibles en el mercado (por ejemplo, EpiSkin, EpiDerm FT). Sin embargo, su coste (100-400 € por pieza) y el plazo de entrega (unos pocos días-semanas) pueden animar al investigador a intentar elaborar un modelo de este tipo por su cuenta. Los procedimientos propuestos son fáciles de realizar incluso para científicos inexpertos y, al mismo tiempo, permiten obtener modelos de piel muy avanzados. Vale la pena enfatizar que la decisión sobre la composición celular de un modelo dado depende completamente del investigador. Aparte del modelo creado, se puede desarrollar y mejorar aún más, lo que abre perspectivas de investigación completamente nuevas. En el caso de los modelos comerciales, es necesario comprar un equivalente diferente.

Aunque los cultivos celulares 3D pueden ser avanzados con múltiples tipos de células, fáciles de manejar y accesibles, siguen siendo solo modelos artificiales que no pueden recrear completamente la complejidad y funcionalidad del tejido (por ejemplo, funciones inmunológicas, vascularización). Es por ello que, en la mayoría de los estudios, se requieren varios modelos para confirmar los resultados obtenidos. En la Tabla 9 se recogieron algunas ventajas y desventajas de estos modelos, así como sus limitaciones. Por otro lado, los modelos comerciales garantizan altos estándares cualitativos con reproducibilidad de los experimentos y comparabilidad de los datos entre los laboratorios. Para implementar el uso de un nuevo compuesto para la investigación, sin duda será necesario comprar el equivalente comercial adecuado. Pero en la fase preparatoria, un modelo 3D de la piel de este tipo, hecho por uno mismo (esfera de tipo multicelular o equivalente) puede ayudar a reducir el número de experimentos necesarios para llevar a cabo en un equivalente comercial. El objetivo de producir y utilizar los modelos descritos no es eludir la necesidad de aplicar modelos de investigación certificados, sino facilitar la investigación y reducir los gastos relacionados.

Par de modelos comparados	Ventajas	Desventajas
Cultivo celular vs. animales	Sufrimiento animal minimizado	Información limitada sobre la influencia de un factor probado en todo el cuerpo
	Alta estandarización de los experimentos: mejor reproducibilidad de los resultados	Un solo modelo no es suficiente para reflejar los procesos que ocurren en el cuerpo
	Sin efectos secundarios para todo el organismo	–
	Mejor control sobre las condiciones del experimento	–
	Posibilidad de automatización (por ejemplo, bioimpresión)	–
	Costos más bajos	–
	El pequeño tamaño de la muestra necesaria	–
	Cantidad limitada de residuos generados	–
Culturas 3D vs. 2D	Reflejar mejor todo el organismo	Cultura que consume mucho tiempo
	Posibilidad de crear un tejido funcional	Costos más altos
	Posibilidad de crear un modelo adaptado a las necesidades de la investigación realizada	La formación espontánea de una estructura 3D es casi imposible
	–	Falta de pruebas estandarizadas para cuantificar los efectos de varios compuestos
	–	Acceso limitado a las diferentes culturas 3D disponibles en el mercado
Línea celular vs. células primarias	Modelos certificados y homologados	Solo hay un número limitado de líneas celulares disponibles
	Alta estandarización de los experimentos: mejor reproducibilidad de los resultados	Posibilidad limitada de obtener varios tipos de células del mismo donante
	Mayor vida útil	Puede poseer propiedades modificadas de las células nativas
	Tasa de proliferación bastante rápida	Alteración frecuente de la funcionalidad de las células
	Menos sensible a varias actividades (p. ej., congelación, centrifugación)	–

Tabla 9: Comparación del uso de diferentes modelos en investigación: ventajas vs. desventajas

Varios artículos describen cómo preparar modelos de piel en 3D (aparte de los artículos de revisión que resumen los modelos disponibles comercialmente 14,43,44, generalmente se centran en una sola metodología para obtener esferas⁴⁵ o equivalentes ⁴⁶).

En este artículo se describieron dos metodologías para la formación de esferas con células cutáneas. El método de caída colgante es ampliamente utilizado, pero su repetibilidad y estabilidad pueden ser insuficientes en algunos casos. La mayoría de los pasos requieren acciones específicas, como el trabajo a alta velocidad debido a la evaporación del agua de las gotas durante la transferencia. También se recomiendan movimientos suaves, ya que la falta de tal habilidad puede resultar en daño al agregado celular^31,32. Por lo tanto, un método más fácil para la preparación de la esfera se centra en limitar la adhesión de las células. La ausencia de una buena superficie para la adhesión celular promueve mayores interacciones entre las células. Como consecuencia, se generan agregados de células. Su repetibilidad es mucho mayor, ya que no hay necesidad de transferencia de esferas. Con estos métodos, el número óptimo de células de la piel para crear una esfera se estableció en 1 x 10⁴ células/esfera.

A continuación, se mostraron los procedimientos que describen la preparación de los equivalentes cutáneos. Su apariencia y funcionalidad en la investigación pueden depender en gran medida de los elementos a partir de los cuales se construyen, incluidas las células (Tabla 2), los andamios y los medios. Los andamios 3D utilizados para la preparación de la piel artificial se pueden dividir en hidrogeles sintéticos y aquellos formados a partir de fuentes naturales. Dependiendo del material utilizado y de sus propiedades para componer el hidrogel, puede surgir la necesidad de complementar adicionalmente el medio. Los hidrogeles sintéticos requieren la incorporación de moléculas bioactivas (proteínas, enzimas y factores de crecimiento) en la red de hidrogeles sintéticos para mediar funciones celulares específicas⁴⁷. Los principales enfoques presentados en la literatura para lograr la entrega controlada de factores de crecimiento a los hidrogeles incluyen la carga directa, la interacción electrostática, la unión covalente y el uso de portadores⁴⁸. Los hidrogeles formados a partir de fuentes naturales, como las proteínas y los polímeros ECM, pueden generar vías fluidas a lo largo del andamio 3D, acelerando la distribución de nutrientes; Por lo tanto, no es necesario complementar el medio. Las investigaciones han demostrado que las moléculas pequeñas (como las citocinas y los factores de crecimiento) y las macromoléculas (incluidos los glicosaminoglicanos y los proteoglicanos) pueden ser transportadas a través de la MEC por difusión⁴⁷. Sin embargo, la difusión molecular de oxígeno, nutrientes y otras moléculas bioactivas puede verse obstaculizada por las propiedades del propio hidrogel ECM. La menor difusión se correlacionó con el mayor espesor del hidrogel, pero también con una concentración muy alta de colágeno³⁷. En este estudio, para crear el equivalente cutáneo, se utilizó una baja concentración de colágeno igual a 2 mg/mL, lo que sugiere que la difusión molecular a través del hidrogel debe ser buena y rápida. Por lo tanto, no se proporcionó ninguna suplementación adicional al medio en esta etapa ni al hidrogel en sí. Para imitar la dermis, se incrustaron mastocitos y fibroblastos (1:10) en el hidrogel de colágeno. A continuación, se sembraron melanocitos y queratinocitos (1:15) en el hidrogel y se cultivó todo el equivalente en el medio. Vale la pena mencionar que el medio básico está compuesto por varios aminoácidos, ácidos inorgánicos y vitaminas, y además se complementa con suero (que consta de múltiples: factores de crecimiento y unión para las células, lípidos, hormonas, nutrientes y fuentes de energía, portadores, proteínas de unión y transferencia, etc.). Para lograr la estructura adecuada de la epidermis, se deben agregar diferentes suplementos al medio en un momento determinado. El estimulador más importante para iniciar la diferenciación epidérmica es el calcio, ya que activa la señalización intracelular. El ácido ascórbico estimula una vía de señalización similar a la mediada por el calcio, pero su efecto también va acompañado de un mayor transporte de ascorbato y la prevención del^{agotamiento de} antioxidantes hidrofílicos. Además, la diferenciación de las células mejoró cuando se añadieron otros componentes al medio (como cafeína, hidrocortisona, triyodotironina, adenina y toxina del cólera)^41,44. Es importante que siempre se compruebe la presencia de un determinado tipo de célula en la capa adecuada. La presencia de los cuatro tipos de células de la piel se confirmó en la estructura del equivalente creado por la tinción con H&E.

El problema más común encontrado es la delicadeza e intuición en el manejo de los modelos obtenidos. Algunas dificultades pueden estar relacionadas con la formación de la esfera celular, así como con la preparación del hidrogel. Durante el cultivo celular, también pueden ocurrir otros problemas; estos incluyen infecciones microbianas, baja tasa de proliferación de células, envejecimiento de las células primarias utilizadas en los modelos, tiempo máximo de cultivo de modelos 2D y 3D reconstruidos a partir de células primarias frente a líneas celulares, etc. En la Tabla 10 se recogieron algunos consejos prácticos sobre qué hacer cuando se encuentra con uno de los siguientes problemas.

Problemas comunes en el cultivo celular	Sugerencias
Infección microbiana	Si se produce una infección microbiana en uno de los matraces/placas con células, es mejor retirar el cultivo infectado lo más rápidamente posible (no contaminar los matraces/placas restantes con células). Vuelva a congelar un nuevo vial con células. Si la infección reaparece, es bueno tratar de ampliar los espectros de los antibióticos aplicados y aumentar su concentración.
Baja tasa de proliferación de células	Algunas células tienen un tiempo de duplicación prolongado. Para estimular su proliferación, se pueden añadir varios factores de crecimiento específicos de la célula al medio básico. Además, el aumento de la concentración de FBS o L-glutamina en el medio basal puede ayudar a estimular el crecimiento de las células.
Envejecimiento de las células primarias utilizadas en los modelos	Después de unos pocos pasajes, las células primarias entran en senescencia y dejan de dividirse. Para superar este problema en los modelos, se recomienda utilizar las celdas desde el paso más temprano posible para construir el modelo.
Tiempo máximo de cultivo de modelos 2D y 3D reconstruidos a partir de células primarias frente a líneas celulares	El tiempo de cultivo de un modelo depende en gran medida del tipo de células utilizadas. Con las células primarias, el tiempo de cultivo será más corto debido a su corta vida útil.
Dificultades en la formación de la esfera celular	Algunas células pueden requerir más tiempo para la formación de esferas. Si después de unos días más no se han formado las esferas, recoja las células de la muestra y verifique su viabilidad con, por ejemplo, tinción con azul de tripano.
Problemas con la estabilidad de la esfera	Si las esferas no son estables y se destruyen durante la manipulación, intente crear esferas a partir de un número menor de celdas. Asegúrese de transferir siempre suavemente los platos en los que crecen las esferas.
Dificultades con la preparación del hidrogel	Compruebe si la proporción de los ingredientes (agua, PBS [10x], NaOH, colágeno tipo 1) era correcta. La solución madre de colágeno suele ser muy densa, por lo que asegúrate de pipetearla lentamente. Las burbujas de aire alteran la morfología del hidrogel, por lo que el pipeteo inverso del gel puede ayudar con este problema.

Tabla 10: Solución de problemas de cultivos celulares

Los modelos establecidos después de la fabricación se pueden utilizar en múltiples campos, comenzando con (1) experimentos de citotoxicidad y genotoxicidad de nuevos compuestos con actividad biológica para su uso en medicamentos y cosméticos⁴⁹, (2) experimentos con estimulación de varios factores⁵⁰, (3) investigación básica que aumenta nuestro conocimiento sobre las células de la piel, sus funciones biológicas, interacciones con otras células y el medio ambiente⁵¹^,⁵², (4) investigación sobre entidades patológicas seleccionadas en las que se puede introducir un tipo específico de célula en el modelo creado (células cancerosas, células con una mutación en un gen determinado, ^etc.14,53) y muchas más. No hace falta decir que la aplicación de estos modelos se mantiene de acuerdo con el principio de las 3R para un uso más ético de los animales en las pruebas de productos y la investigación científica y no viola la ley de prohibición de las pruebas de productos cosméticos en animales.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen el apoyo financiero brindado por la Universidad Tecnológica de Varsovia del programa ‘Iniciativa de Excelencia – Universidad de Investigación’ en forma de dos becas: POB BIB BIOTECHMED-2 start (n.º 1820/2/ZO1/POB4/2021) y la beca del Rector para Grupos de Investigación Estudiantil (SKIN-ART, n.º 1820/116/Z16/2021). Además, los autores desean agradecer el apoyo recibido de la Prof. Joanna Cieśla y de la Cátedra de Biotecnología de Medicamentos y Cosméticos, así como del Club de Ciencias de Biotecnología “Herbion” de la Facultad de Química de la Universidad Tecnológica de Varsovia. Un agradecimiento especial al Dr. Michał Stepulak por proporcionar el compuesto Pluronic F-127.

Materials

24-well plate for adherent cell culture	Biologix Europe GmbH	07-6024	–
35%–38% HCL	Chempur	115752837	–
60 mm cell culture Petri dish	Nest	705001	–
Avidin−Sulforhodamine 101	Sigma Aldrich	A2348-5MG	–
Bright-field inverted microscope	Olympus	CKX41	–
Calcium chloride	Avantor	874870116	–
Cell culture flask T75 for adherent cells	Genoplast	G77080033	–
Centrifuge tube 15 mL	GoogLab Scientific	G66010522	–
CO2 Incubator	Heal Force	Galaxy 170R	–
Col1A2 antibody produced in rabbit	Novus	NBP2-92790	–
Corning(R) Transwell(R) Polycarbonate	Corning	CLS3422-48EA	–
Cytokeratin 14 antibody produced in mouse	Novus	NBP1-79069	–
DPX Mountant for histology	Sigma Aldrich	06522-100ML	–
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	VWR Chemicals	L0102-500	–
Eosine Y	Kolchem	–	0.5 % aquatic solution
Eppendorf tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001	–
Eppendorf tube 2 mL	Sarstedt	72.691	–
Ethyl alcohol absolute 99.8%	Avantor	396480111	diluted in ultrapure water to the needed concentrations
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	–
Fluorescent inverted microscope	Olympus	IX71	–
Goat anti-mouse secondary antibody conjugated with FITC	Sigma Aldrich	F0257-1mL
Goat anti-rabbit secondary antibody conjugated with FITC	Novus	NB7159	–
Harris Hematoxylin	Kolchem	–	1 mg/mL in 95% ethanol
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	–
Laminar chamber	Heal Force	HFSafe-1200	–
Melan-A antibody produced in mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-20032	–
Microtome	Microm	HM355S	–
NaOH	Avantor	810981997	–
Paraffin pastilles	Sigma Aldrich	1.07164	–
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	1581227	–
Penicillin/Streptomycin solution	Sigma Aldrich	P4333	–
Pipette tip, 1000 µL	Sarstedt	70.305	–
Pipette tip, 20 µL	Sarstedt	70.3021	–
Pipette tip, 200 µL	Sarstedt	70.303	–
Pluronic F-127	BASF	50401036	–
Serological pipette 10 mL	GoogLab Scientific	G33270011	–
Serological pipette 25 mL	GoogLab Scientific	G33280011	–
Serological pipette 5 mL	GoogLab Scientific	G33260011	–
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	–
Sodium bicarbonate	Chempur	118105307
Trypsin-EDTA 0.25% solution, phenol red	Sigma Aldrich	25200072	–
Type 1 collagen	IBIDI	50201	–
U-bottom 96-well plate	Sarstedt	83.3925500	–
Xylene	Sigma Aldrich	534056	–

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Diesen Artikel zitieren

Piasek, A. M., Levkovych, I., Musolf, P., Chmielewska, H., Ścieżyńska, A., Sobiepanek, A. Building Up Skin Models for Numerous Applications – from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture. J. Vis. Exp. (200), e65773, doi:10.3791/65773 (2023).