Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen

1. Voorbereiding van het rooster OPMERKING: Plan in het experimentele ontwerp voor maximaal 8-12 roosters in totaal per invriessessie en 4-5 roosters per put. Meer dan dat zal leiden tot een zeer lange vriessessie, wat kan leiden tot verhoogde celstress, ijsverontreiniging en gebruikersfouten. Gloed ontladingLaad een geschikt aantal roosters met een geperforeerde koolstofsteunfilm die moet worden ontladen bij 15 mA gedurende 45 s bij een atmosfeer van 0.39 mBar in een gloeiontladingsapparaat. Zorg ervoor dat de koolstofzijde van het rooster naar boven wijst. Als u klaar bent, plaatst u de roosters in een schone bak bekleed met filtreerpapier (Figuur 1A1).OPMERKING: Andere roosters mogen worden gebruikt zolang het materiaal niet giftig is voor cellen (wat elk koperen rooster uitsluit). Finder grids zijn handig voor correlatieve studies. Roosters van andere materialen zijn ook mogelijk. Veel laboratoria hebben goede resultaten behaald met het kweken van cellen bovenop SiO 2-ondersteuningsrasters 8,9. Hechte behandelingBreng de roosters, fibronectine, PBS, platen en pincetten over naar een bioveiligheidskast. Behandel beide zijden van de roosters met 20 μg/ml runderfibronectine door twee ruime stippen hechtende oplossing te micropipetteren op een steriel oppervlak, zoals het deksel van een plaat met 6 putjes. Zorg ervoor dat de stippen groot genoeg zijn om het hele rooster te omhullen (ongeveer 100 μL wordt aanbevolen).OPMERKING: Voorafgaand aan de behandeling met de geselecteerde hechtende oplossing, is er de mogelijkheid om het raster hier te micro-micropatronen te geven om de bevestiging van cellen in het midden van rastervierkanten te optimaliseren. Door het vermogen van cellen om zich aan de staven te hechten te verminderen, neemt het aantal beeldbare cellen toe. Dit is ideaal voor experimenten met cryoFIB-frezen. Gebruik een 5/15 pincet om de roosters te manipuleren. Zorg ervoor dat u beide zijden van het rooster in oplossing behandelt.OPMERKING: Er kunnen andere zelfklevende oplossingen worden gebruikt (fibrinogeen, collageen, andere extracellulaire matrixcomponenten, enz.). Fibronectine wordt hier gebruikt, omdat het goede resultaten geeft met een grote verscheidenheid aan cellijnen. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). De 5/15 pincet is handig omdat de geometrie een betere manoeuvreerbaarheid mogelijk maakt rond de 6-wells platen, 35 mm schalen en microglaasjes. Dit resulteert in minder mechanische belasting van de roosters en een meer intacte koolstoffilm. Zorg ervoor dat alle benodigde materialen voor aanvang in de bioveiligheidskast zijn geplaatst, omdat dit de kans op netverontreiniging verkleint. Roosters bevestigenEenmaal behandeld met runderfibronectine, wordt het rooster plakkerig. Raak met een 5/15 pincet voorzichtig het koolstofvrije oppervlak van het rooster aan tegen de bodem van een lege schaal/bord en open het pincet. Het rooster moet gemakkelijk aan het nieuwe oppervlak kunnen worden bevestigd (Figuur 1A2).NOTITIE: Probeer te voorkomen dat u roosters in het midden of aan de randen van de schaal/het bord plaatst. Bij het toevoegen van cellen is er een tendens dat de celdichtheid zich ophoopt in het midden van de plaat. Dit kan resulteren in roosters met een te hoge celdichtheid. Als alternatief kunnen hier 3D-geprinte roosterhouders worden gebruikt in plaats van cellen rechtstreeks op het oppervlak van de schaal/plaat12 te bevestigen. IncubatieIncubeer de roosters gedurende 30 minuten in de fibronectine-adherente oplossing (20 μg/ml). Om ervoor te zorgen dat de roosters tijdens dit proces niet droog worden, moet u elke 15 minuten 1-2 druppels van de meer hechtende oplossing rechtstreeks op de roosters pipetten (Figuur 1A3).NOTITIE: De incubatietijd is afhankelijk van de gebruikte hechtende oplossing. Voor runderfibronectine is de aanbevolen tijd 30 minuten. WasVerwijder na de incubatietijd overtollige aanhangende oplossing via micropipetteren. Was de roosters door PBS-druppels direct op de roosters te micropipetteren. Herhaal dit 2-3 keer. (Figuur 1A4). SterilisatieGebruik UV-licht om de roosters in de bioveiligheidskast gedurende 1 uur te steriliseren. Plaats de roosters zo dicht mogelijk bij de UV-bron om de sterilisatie te maximaliseren (Figuur 1A5). Om ervoor te zorgen dat de roosters tijdens dit proces niet droog worden, micropipetteer u elke 10 minuten 1-2 druppels PBS rechtstreeks op de roosters.OPMERKING: Stappen 1.4-1.6 kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd. 2. Zaairoosters Cellen tellen:Maak de cellen los en tel ze met behulp van mechanische of enzymatische methoden. Bepaal het optimale aantal cellen dat moet worden gebruikt voor het zaaien voordat u gaat tellen. Gebruik voor U2OS gezaaid in een plaat met 6 putjes ergens tussen 6 x 104 tot 1.6 x 105 cellen per putje (Figuur 1B1).OPMERKING: Het aantal cellen dat wordt gezaaid, is afhankelijk van het celtype, de oppervlakte van de gebruikte put, schaal of microglijbaan, de tijd tussen zaaien en invriezen en het experimentele ontwerp. Test een reeks celnummers om omstandigheden te identificeren die resulteren in 0.25-1 cellen per rastervierkant op het moment van invriezen. Het is belangrijk op te merken dat een hoge celdichtheid de snelheid van warmteoverdracht vermindert en het verglazingsproces kan beïnvloeden. Om dit tegen te gaan, hebben sommige laboratoria succes geboekt met het gebruik van celzeven, die voorkomen dat celklonten zich vormen13. Ten slotte resulteert dit protocol in de willekeurige aanhechting van cellen aan de koolstoflaag. Als een gerichte bevestiging nodig is, kan foto-micropatroonvorming worden gebruikt (zie stap 1.3)14. Toevoegen van cellen en groeimedium : Voeg cellen via een micropipet toe aan de putjes en vermijd luchtbellen (figuur 1B2). In een plaat met 6 putjes wordt een totaal putvolume van 1,5-2,0 ml aanbevolen.NOTITIE: Het wordt aanbevolen om de roosters zorgvuldig nat te maken voordat u het volledige volume toevoegt. Dit helpt voorkomen dat roosters losraken en in de oplossing zweven. Beweeg de plaat voorzichtig heen en weer om een homogene celverdeling op de put te vergemakkelijken. Draai de plaat niet in een cirkelvormige beweging, omdat dit zal resulteren in een overmatige celdichtheid in het midden van de put. Incubatie: Incubeer de objectglaasjes bij 37 °C gedurende een geschikte tijd volgens het experimentele ontwerp, dat afhankelijk is van de stroomafwaartse toepassingen. Voor dit voorbeeld (transfectie van moleculaire klonen van HIV) incubeer tussen 16-24 uur (Figuur 1B3).OPMERKING: Langere incubatietijden resulteren in meer celdelingscycli. Pas daarom het startaantal cellen voor het zaaien dienovereenkomstig aan. 3. Transfectie Bereiding van het transfectiemengsel:Bereid een geschikt kationisch liposoomreagens voor plasmidetransfectie in de geselecteerde cellijn. Gebruik in dit transfectievoorbeeld 1 μg totaal plasmide-DNA per putje (in een plaat met 6 putjes) om te worden getransfecteerd in een verhouding van 1:3 van HIViΔEnv-plasmide tot psPAX2-plasmide. Verdun voor elk putje 1 μg DNA tot 50 μL serumvrije DMEM. Homogeniseer het mengsel door herhaaldelijk te micropipetteren of de plaat zachtjes rond te draaien. Verdun voor elk putje 3 μL transfectiereagens in serumvrije DMEM en homogeniseer het mengsel vervolgens opnieuw door middel van micropipetteren of zachtjes ronddraaien. Voeg het volledige verdunde transfectiereagensmengsel toe aan het verdunde DNA-mengsel (stap 3.1.2) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) (figuur 1C1).OPMERKING: Terwijl dit mengsel aan het broeden is, vervangt u de media in de putjes door 1,5 ml verse DMEM. Pas op dat u de roosters niet losmaakt van de bodem van de put. Om het transfectiemengsel aan te brengen, pipetteer u 100 μl van het mengsel uit stap 3.1.3 druppelsgewijs op elk putje, waarbij u de druppels concentreert op de roosters om contact te maken (figuur 1C2). Vervang het groeimedium 16-24 uur na transfectie (Figuur 1C3). 4. Invriezen NOTITIE: Houd de cellen op 37 °C totdat ze nodig zijn om te deppen. Zorg er bovendien voor dat u tijdens het hele proces de koolstofkant van de roosters noteert. CeldichtheidControleer de roosters in een omgekeerde optische microscoop en noteer de celdichtheden op elk rooster.OPMERKING: Rasters met minder dan 0,25 cellen per rastervierkant (of één cel per 4 rastervierkanten) worden als ‘leeg’ beschouwd. Roosters met 0,25-1 cellen per rastervierkant worden als ‘normaal’ beschouwd. Rasters met meer dan 1 cel per rastervierkant worden als ‘vol’ beschouwd. Let op de celdichtheid op elk rooster om de deppingstijden later tijdens het invriezen te kunnen invriezen. Voeg 2-3 ml PBS toe aan een leeg bord/schaal en verwarm tot 37 °C. Fiducials voorbereidenOm goudfiducials voor te bereiden op stroomafwaartse cryotomografietoepassingen, pipetteer 50 μl colloïdale goudpareloplossing van 10 nm in een schoon buisje van 1,5 ml. Voeg 2 μL van 1 mg/ml BSA toe aan de buis en homogeniseer door herhaaldelijk te micropipetteren. Centrifugeer de buis bij 15.000-20.000 x g gedurende 15 minuten. Micropipet om zoveel mogelijk van het supernatans te verwijderen zonder de pellet te verstoren.OPMERKING: De pellet zal erg los zitten. Voeg 50 μL PBS toe aan de pellet en resuspendeer. Centrifugeer de buis opnieuw bij 15.000-20.000 x g gedurende 15 minuten. Zuig met een tip van 10 μL direct 4 μL van de pellet op en breng deze over in een schone buis van 1.5 ml (Figuur 1D 1). Gebruik 1 μL van het gewassen en geconcentreerde goud per rooster.OPMERKING: Het type fiducials dat wordt gebruikt, is afhankelijk van downstream-toepassingen. Gebruik voor TEM-tomografie 10 nm gouden kralen. Gebruik voor zachte röntgentomografie gouden kralen van 200 nm. Gebruik voor correlatiemicroscopie fluorescerende latexparels. Fiducials zijn normaal gesproken niet nodig voor experimenten met cryoFIB-frezen, omdat het maalproces ze zal vernietigen. BevlekkenStel de klimaatkamer in op een luchtvochtigheid van 95% en 30°C (Figuur 1D 1). Selecteer een raster met behulp van het 5/15 pincet. Was de roosters met PBS en leg ze op een pincet (Figuur 1D2). Eenmaal vastgezet, verwijdert u het 5/15 pincet en schuift u de klem op het insteekpincet. Plaats het rooster in de vrieskou en houd de klem stevig vast (Figuur 1D3). Voeg 1 μL gouden fiducials toe aan de achterkant van het rooster (Figuur 1D4). Voeg 2-3 μL PBS toe aan de koolstofzijde van het rooster. Gebruik geautomatiseerd deppen om de achterkant van het rooster te deppen en vries het in vloeibaar ethaan onder (Figuur 1D5).NOTITIE: Het wordt aanbevolen om tussen de 3-4 μL volume per rooster te hebben voor een optimale depping. Roosters kunnen na het wassen een variabele hoeveelheid PBS behouden. Pas het toegevoegde volume van PBS aan om rekening te houden met reeds bestaande vloeistofretentie op het rooster. Het wordt aanbevolen om de gouden fiducials aan de achterkant van het rooster toe te voegen. Toevoeging aan de voorkant kan resulteren in pools van gouden fiducials in de buurt van het punt van inbrengen, terwijl toevoeging van de achterkant resulteert in een meer gehomogeniseerde oplossing. De duur van het deppen is afhankelijk van de tandheelkunde van de cel. 2 s voor lege, 3 s voor normale en 4 s voor volle roosters. Het type dompelvriezer dat beschikbaar is, kan bepalen hoe blotting wordt benaderd: de Leica GP2 plunge freezer wordt in dit protocol gebruikt en is standaard in staat tot geautomatiseerd enkelzijdig blotting. Thermo Fisher Vitrobot voert geautomatiseerde dubbelzijdige blotting uit, hoewel dit vaak de cellen beschadigt die aan de koolstofzijde zijn bevestigd. Handmatig blotting in de Vitrobot is ook mogelijk, evenals handmatige zwaartekrachtplunjers.