Nadir Primer Hücrelerde Hedeflenen Metabolomikler

Metabolizma, tüm canlı hücrelerde meydana gelen önemli bir biyolojik süreçtir. Metabolik süreçler, hücrelerin enerji üretmesine ve temel biyomolekülleri sentezlemesine izin veren, sıkı bir şekilde düzenlenmiş ve birbirine bağlı geniş bir biyokimyasal reaksiyon ağını içerir¹. Metabolik ağların işlevini anlamak için araştırmacılar, hücrelerdeki küçük moleküllü ara ürünlerin seviyelerini ölçerler. Bu ara ürünler, metabolik aktivitenin önemli göstergeleri olarak hizmet eder ve hücresel fonksiyona ilişkin kritik bilgileri ortaya çıkarabilir.

Kütle spektrometresi (MS), karmaşık numunelerde metabolitlerin spesifik tespiti için en popüler seçimdir ^1,2. Nükleer manyetik rezonans (NMR), bileşiklerin mutlak miktar tayininde ve yapı aydınlatmasında avantajlara sahiptir, ancak MS genellikle biyoakışkanlar veya hücre ekstraktları gibi karmaşık karışımlarda daha fazla bileşeni çözebilir. Çoğu zaman MS, bileşiğin kapiler elektroforez (CE), gaz kromatografisi (GC) veya sıvı kromatografisi (LC) ile önceden ayrılması ile ^{birleştirilir3}. Separasyon platformunun seçimi çoğunlukla hedef metabolitlerin aralığı ve numunenin türü ve gerçek dünya ortamında makinelerin ve uzmanlığın mevcudiyeti tarafından yönlendirilir. Her üç ayırma platformunun da geniş ve örtüşen bir uygun metabolit aralığı vardır, ancak farklı sınırlamalar vardır. Kısaca CE, yalnızca yüklü molekülleri ayırabilir ve çok sayıda numunenin sağlam analizini uygulamak için çok fazla uzmanlık gerektirir⁴. GC, ayrışmadan önce buharlaşacak kadar küçük ve apolar moleküllerle sınırlıdır³. Piyasada bulunan tüm LC kolonları göz önüne alındığında, herhangi iki metabolit bu teknoloji ile ayrılabilir⁵. Bununla birlikte, birçok LC yöntemi, benzer uzunluktaki CE veya GC yöntemlerinden daha az çözme gücü sergiler.

Metabolomik ölçümler için tipik başlangıç materyali miktarı genellikle numune başına 5 x 10⁵ ila 5 x 10⁷ hücre, 5-50 mg ıslak doku veya 5-50 μL vücut sıvısı⁶ aralığındadır. Bununla birlikte, örneğin hematopoietik kök hücreler (HSC’ler) veya dolaşımdaki tümör hücreleri gibi nadir hücre tiplerinin birincil hücreleriyle çalışırken bu miktarlarda başlangıç materyali elde etmek zor olabilir. Bu hücreler genellikle çok düşük sayılarda bulunur ve kritik hücresel özelliklerden ödün vermeden yetiştirilemez.

HSC’ler ve multipotent progenitör hücreler (MPP’ler), hematopoetik sistemin en az farklılaşmış hücreleridir ve bir organizmanın yaşamı boyunca sürekli olarak yeni kan hücreleri üretir. Hematopoezin düzenlenmesi, lösemi ve anemi gibi durumlarda klinik öneme sahiptir. Önemlerine rağmen, HSC’ler ve MPP’ler hematopoetik sistemdeki en nadir hücreler arasındadır. Tek bir fareden, tipik olarak, yaklaşık 5000 HSC^{izole edilebilir 7,8,9}. Geleneksel metabolomik yöntemler daha fazla girdi materyali gerektirdiğinden, nadir hücre tiplerini analiz etmek için genellikle birden fazla fareden alınan hücrelerin toplanması gerekliydi^10,11.

Burada, tek bir farenin HSC’lerinden metabolomik verilerin üretilmesini sağlamak için numune başına 5000 hücrede metabolitlerin ölçülmesini sağlayan bir protokol geliştirmeyi amaçladık¹². Aynı zamanda, bu yöntem, lenfositler gibi daha bol hücre tipleri için tek bir fareden birden fazla kopya oluşturmaya izin verir. Bu yaklaşım, belirli bir proje için gereken hayvan sayısını azaltır, böylece hayvan deneylerinin “3R” (azaltma, değiştirme, iyileştirme) özelliğine katkıda bulunur.

Hücrelerdeki metabolitler, genellikle saniye mertebesinde çok yüksek devir oranlarına sahip olabilir¹³. Bununla birlikte, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için numunelerin hazırlanması saatler sürebilir ve FACS sıralamasının kendisi dakikalar ila saatler sürebilir ve bu da fizyolojik olmayan koşullar nedeniyle metabolomda potansiyel değişikliklere yol açabilir. Bu protokolde kullanılan bazı reaktifler (amonyum-klorür-potasyum [ACK] lizis tamponu gibi) benzer etkilere sahip olabilir. Bu koşullar hücresel strese neden olabilir ve hücrelerdeki metabolitlerin seviyelerini ve oranlarını etkileyerek hücresel metabolizmanın yanlış veya önyargılı ölçümlerine yol açabilir 14,15,16. Numune hazırlamaya bağlı metabolik değişiklikler bazen tasnif artefaktları olarak adlandırılır. Sert veya sert dokulardan tek hücreli süspansiyonlar üretmek için gerekli olabilecek uzun sindirim protokolleri ve sert reaktifler bu sorunu daha da kötüleştirebilir. Hangi değişikliklerin meydana gelebileceği muhtemelen hücre tipine ve işlem durumuna bağlıdır. Canlı dokudaki bozulmamış hücrelerin metabolik durumu ölçülemediğinden, değişikliklerin kesin doğası bilinmemektedir.

Burada sunulan protokol, geleneksel yöntemlere kıyasla birkaç önemli farklılık içerir, yani kılıf sıvısı olarak 5 g/L NaCl kullanımı, doğrudan ekstraksiyon tamponuna ayırma, hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (HILIC-MS) üzerine büyük numune hacimlerinin enjekte edilmesi ve hedeflenen miktar tayininin kullanılması, dahili standartların ve arka plan kontrollerinin titiz kullanımı (Şekil 1). Bu protokol, hücre tipleri arasındaki ve ilaç tedavisi ile araç kontrolü arasındaki farklılıkları büyük ölçüde koruma potansiyeline sahiptir¹². Kültürlenmiş hücreler için bile, daha yerleşik santrifüjleme ve süpernatantın manuel olarak çıkarılması gibi alternatif yaklaşımlarla olumlu bir şekilde karşılaştırılır. Ancak, sıralama yapıtları yine de gerçekleşebileceğinden, veriler dikkatle yorumlanmalıdır. Bu sınırlamaya rağmen, protokol, nadir birincil hücrelerde hücresel metabolizmanın daha doğru ve kapsamlı ölçümlerine izin veren metabolik profilleme alanında önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir¹².

Nadir birincil hücrelerde geniş metabolik profilleri sağlam bir şekilde ölçme yeteneği, bu hücreleri içeren biyomedikal araştırmalarda yeni deneylere kapı açar. Örneğin, HSC’lerde metabolik aracılı düzenlemenin, anemi ve lösemi için etkileri olan uyku halinin kendini yenileme kapasitesini etkilediği gösterilmiştir^11,17. Hasta kaynaklı dolaşımdaki tümör hücrelerinde, tümör ve komşu hücreler arasındaki metabolik genlerin ekspresyonunda farklılıklar gösterilmiştir^18,19. Bu protokol şimdi araştırmacıların bu farklılıkları sistematik olarak metabolik düzeyde incelemelerine izin veriyor, bu da genellikle hücresel fenotipe gen ekspresyonundan daha yakın olarak kabul ediliyor.