Préparation de graines de palmier dur pour l’analyse par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice
Summary
Ce protocole visait à décrire des directives détaillées sur la préparation de sections d’échantillons de graines dures à faible teneur en eau pour l’analyse MALDI-IMS, en maintenant la distribution et l’abondance d’origine des analytes et en fournissant un signal de haute qualité et une résolution spatiale.
Abstract
La spectrométrie de masse par désorption/ionisation-imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS) est appliquée pour identifier les composés dans leur environnement d’origine. Actuellement, MALDI-IMS est fréquemment utilisé dans les analyses cliniques. Pourtant, il existe une excellente perspective pour mieux appliquer cette technique afin de comprendre les informations physiologiques des composés chimiques dans les tissus végétaux. Cependant, la préparation peut être difficile pour des échantillons spécifiques de matériaux botaniques, car MALDI-IMS nécessite des tranches minces (12-20 μm) pour une acquisition de données appropriée et une analyse réussie. En ce sens, nous avons précédemment développé un protocole de préparation d’échantillons pour obtenir de fines coupes de graines dures d’Euterpe oleracea (palmier açaí), permettant leur cartographie moléculaire par MALDI-IMS.
Ici, nous montrons que le protocole développé est adapté à la préparation d’autres graines du même genre. En bref, le protocole était basé sur l’immersion des graines dans de l’eau désionisée pendant 24 heures, l’enrobage d’échantillons avec de la gélatine et leur coupe dans un cryostat acclimaté. Ensuite, pour le dépôt de la matrice, une plate-forme de mouvement xy a été couplée à une pulvérisation à aiguille par ionisation par électronébulisation (ESI) utilisant une solution d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) 1:1 (v/v) et de méthanol avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique à 30 mg/mL. Les données sur les graines d’E. precatoria et d’E. edulis ont été traitées à l’aide d’un logiciel pour cartographier leurs métabolites.
Les oligomères d’hexose ont été cartographiés dans des coupes d’échantillons pour prouver l’adéquation du protocole pour ces échantillons, car on sait que ces graines contiennent de grandes quantités de mannane, un polymère de l’hexose mannose. En conséquence, des pics d’oligomères d’hexose, représentés par des adduits [M + K]+ de (Δ = 162 Da), ont été identifiés. Ainsi, le protocole de préparation des échantillons, précédemment développé sur mesure pour les semences d’E. oleracea , a également permis l’analyse MALDI-IMS de deux autres graines de palmier dur. En bref, la méthode pourrait constituer un outil précieux pour la recherche en morpho-anatomie et physiologie des matériaux botaniques, en particulier à partir d’échantillons résistants aux coupures.
Introduction
La spectrométrie de masse par désorption/ionisation par imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS) est une méthode puissante qui permet l’affectation bidimensionnelle de biomolécules, fournit une étude non ciblée des composés ionisables et détermine leur distribution spatiale, en particulier dans les échantillons biologiques 1,2. Depuis deux décennies, cette technique permet de détecter et d’identifier simultanément des lipides, des peptides, des glucides, des protéines, d’autres métabolites et des molécules synthétiques telles que des médicaments thérapeutiques 3,4. MALDI-IMS facilite l’analyse chimique à la surface d’un échantillon de tissu sans extraire, purifier, séparer, marquer ou colorer des échantillons biologiques. Cependant, pour une analyse réussie, une étape cruciale de cette technique est la préparation des échantillons, en particulier dans les tissus végétaux, qui sont spécialisés et modifiés en organes complexes répandus en raison de l’acclimatation environnementale5.
En raison des propriétés physico-chimiques inhérentes aux tissus végétaux, il est nécessaire de mettre en place un protocole adapté pour répondre aux exigences de l’analyse MALDI-IMS et préserver la forme originale du tissu lors de la préparation de la coupe 6,7. Dans le cas d’échantillons non conventionnels, tels que les graines, les protocoles établis8 ne sont pas applicables car ces tissus ont des parois cellulaires rigides et une faible teneur en eau, ce qui peut facilement provoquer une fragmentation de la section et conduire à la délocalisation du composé9.
Notre groupe de recherche a publié des données expérimentales sur la cartographie moléculaire et un protocole adapté pour l’analyse MALDI-IMS de la graine d’açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, qui est un sous-produit généré en grande quantité lors de la production de la pulpe d’açaí 13 à louer. L’idée était de développer un protocole de cartographie in situ des différents métabolites dans les graines d’açaí, permettant de suggérer des utilisations possibles de ces déchets agricoles qui ne sont actuellement pas explorées commercialement. Cependant, en raison de la résistance de la graine d’açaí, il a été nécessaire d’élaborer un protocole sur mesure pour obtenir une coupe appropriée de l’échantillon à partir de l’analyse MALDI-IMS.
Dans ce contexte, la pulpe d’açaí, économiquement importante, a motivé la commercialisation croissante d’autres fruits issus de palmiers du genre Euterpe présentant des caractéristiques sensorielles similaires. Les deux fruits émergents des palmiers qui ont été produits à l’échelle industrielle comme alternative à l’açaí14,15 sont E. precatoria (connu sous le nom d’açaí-do-amazonas), qui pousse dans les zones arides de l’Amazonie, et E. edulis (connu sous le nom de juçara), qui est typique de la forêt atlantique. Néanmoins, la consommation d’açaí-do-amazonas et de juçara conduit à la même accumulation de graines résistantes et non comestibles qui ne sont pas utilisées et qui n’ont pas été étudiées jusqu’à présent en ce qui concerne leur composition chimique détaillée.
Ainsi, nous démontrons ici que le protocole précédemment conçu peut être utilisé, avec peu d’adaptations, pour analyser les graines d’E. precatoria et d’E. edulis pour la cartographie moléculaire par MALDI-IMS, s’avérant être un outil puissant qui peut être utilisé pour analyser la composition de ces ressources et peut aider à déterminer leurs utilisations biotechnologiques potentielles. De plus, la description détaillée fournie ici peut aider d’autres personnes ayant des difficultés similaires à préparer des matériaux résistants pour l’analyse MALDI-IMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les plantes sont composées de tissus spécialisés pour des fonctions biochimiques spécifiques. Par conséquent, le protocole de préparation des échantillons pour MALDI-IMS doit être conçu en fonction de divers tissus végétaux ayant des propriétés physicochimiques spécifiques, car les échantillons doivent conserver leur distribution et leur abondance d’analyte d’origine pour un signal de haute qualité et une résolution spatiale8.
Avant l’analyse MALD…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par l’Institut Serrapilheira (Serra-1708-15009) et la Fondation Carlos Chagas Filho pour le soutien à la recherche dans l’État de Rio de Janeiro (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). L’Institut Serrapilheira et le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) ont accordé des bourses au Dr Felipe Lopes Brum et au Dr Gabriel R. Martins (Programme de renforcement des capacités institutionnelles/INT/MCTI). La Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES) est reconnue pour avoir accordé une bourse de maîtrise à M. Davi M. M. C. da Silva. Le Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) est reconnu pour les services fournis avec les analyses MALDI-IMS, et M. Alan Menezes do Nascimento et le Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), financé par la subvention MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ Nº 442604/2019, sont remerciés pour l’analyse de la composition élémentaire.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
Referenzen
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