단일 핵 염기서열분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 단일 핵을 분리하기 위한 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜

모든 동물 연구는 동물 보호에 관한 스위스 연방 규정을 엄격히 준수하거나 독일 동물 복지법에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 바젤-슈타트 주 수의학 당국의 승인을 받아 수행되었습니다. 1. 조직 및 시약/기구 준비 세척 및 기기 준비70% 에탄올 및 RNase 오염 제거 용액으로 탁상과 핀셋을 청소합니다. 원심분리기를 4°C로 사전 냉각합니다. 핵 분리 카트리지를 냉장고의 4°C에서 최소 30분 동안 사전 냉각합니다. 로봇 해리기를 시작하고 화면 오른쪽 상단의 슬라이더를 냉각으로 설정하고 슬라이더가 주황색으로 나타나도록 클릭하여 냉각을 시작하여 냉각을 켭니다. 부착된 NSR(Nuclei Storage Reagent) 병과 NIB(Nuclei Isolation Buffer) 병에 충분한 액체가 남아 있고 적절하게 냉각되었는지 확인하십시오. 드라이 아이스로 채워진 폴리스티렌 폼 상자와 드라이 아이스 위에 미리 식힌 페트리 접시와 메스 블레이드를 준비합니다. 완충액 준비표 1.5에 나타낸 바와 같이 1 M 슈크로스 쿠션 용액(SCS)을 준비한다. SCS를 2mL DNase/RNase 튜브의 500μL 부분 표본으로 분배하여 샘플당 4개의 500μL SCS 부분 표본을 얻습니다. 더 이상 사용할 때까지 부분 표본을 얼음 위에 보관하십시오. 뇌조직을 가공하는 경우, NSR에 실리카 콜로이드 원액을 희석하고 RNase 억제제를 첨가하여 표 2와 같이 18% 실리카 콜로이드 용액을 제조한다. 샘플당 3mL의 18% 실리카 콜로이드 용액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 2. 조직 균질화 및 핵 분리 -80 °C 냉동실에서 샘플을 꺼내 즉시 드라이아이스 위에 놓습니다. 예식된 메스를 사용하여 드라이아이스에 미리 식힌 페트리 접시 또는 금속판에 있는 샘플을 15-50mg 조각으로 자릅니다(아직 올바른 크기가 아닌 경우). 샘플이 여전히 관심 기관 구조를 대표할 수 있도록 샘플을 올바른 방향으로 절단해야 합니다.참고: 이 프로토콜을 사용하면 15-50mg이 핵 추출을 위한 최적의 샘플 크기입니다. 세척 후 양호한 수율을 얻으려면 최소 25mg의 샘플 크기를 권장합니다. 더 작은 샘플의 경우, 로봇 해리기로 작은 입력을 처리하는 데 최적화된 특수 카트리지를 사용할 수 있습니다. 작은 입력 핵 분리 카트리지를 사용하여 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열분석을 위한 충분한 수율로 무게가 4mg에 불과한 조직 샘플을 해리했습니다. 쥐 간 조직으로부터의 낮은 투입 카트리지를 사용한 핵 수율의 예가 표 3에 나타나 있다. 냉장고에서 핵 분리 카트리지를 꺼내 포장을 풀고 그라인더를 꺼내 RNase inhibitor(40U/μL) 15μL를 카트리지 바닥에 피펫팅합니다.알림: 핵 추출 중에 로봇 해리기는 NIB 및 NSR을 카트리지에 총 3mL의 부피로 추가합니다(저용량 핵 추출 프로토콜 사용). 추출 전에 카트리지에 15μL의 RNase 억제제(40U/μL)를 첨가하면 현탁액은 원하는 RNAse 억제제 농도가 0.2U/μL가 됩니다. 티슈 s를 놓으십시오.amp핀셋을 사용하여 카트리지 바닥에 놓습니다. 최적의 파괴 효율을 위해 샘플을 카트리지 중앙에 정확히 배치하지 마십시오. 계측기에서 Run a Protocol(프로토콜 실행 )을 선택하고 왼쪽 상단 모서리에 있는 Nuclei 옵션을 클릭합니다.메뉴에서 Low Volume Nuclei Isolation 프로토콜을 선택하고 Modify(수정)를 클릭하여 중단 속도가 고속으로 설정되어 있는지 확인합니다. 도어를 열고 s를 밀어서 카트리지를 악기에 로드합니다.tage 빨간색 손잡이를 들어 올립니다. 카트리지를 지정된 위치에 삽입하고 카트리지 잠금 장치를 돌린 다음 s에서 밉니다.tage 빨간색 손잡이가 딸깍 소리를 내며 제자리에 고정될 때까지. 도어를 닫고 Next(다음)를 클릭하여 기기에서 핵 추출 실행을 시작합니다. 달리기는 약 7분 동안 지속됩니다. 실행이 끝나면 빨간색 손잡이를 들어 올려 악기에서 카트리지를 제거합니다.tage. 즉시 카트리지를 얼음 위에 놓으십시오. 뇌를 제외한 모든 조직에 대해 3.1단계로 진행합니다. 뇌 샘플의 경우 3.2단계로 바로 진행합니다. 3. 핵 세척 자당 그래디언트 세척참고: 뇌 조직의 경우 이 단계를 건너뛰고 3.2단계로 바로 이동합니다. RNA 분해를 최소화하기 위해 모든 세척 단계는 얼음 위에서 수행됩니다. 버퍼와 튜브, 원심분리기는 사전 냉각되어야 합니다. 모든 재현탁 및 혼합 단계는 볼텍싱이 핵의 품질과 무결성을 손상시킬 수 있으므로 신중한 피펫팅으로만 수행됩니다.피펫 팁으로 분리기 카트리지의 둥근 호일을 조심스럽게 뚫습니다.참고: 해리 후 생성된 핵 현탁액의 부피는 대략 2mL입니다. 슈크로스 그래디언트 클린업을 용이하게 하기 위해 핵 현탁액을 2개의 900μL 부분 표본으로 나누어 클린업 중에 총 1.8mL의 핵 현탁액이 사용됩니다. 카트리지에서 핵 현탁액의 처음 900μL 부분 표본을 제거하고 2mL 튜브에서 미리 준비한 500μL SCS 부분 표본에 추가합니다. 혼합물이 균질해질 때까지 피펫팅하여 잘 섞습니다. 1400μL의 핵 현탁액(SCS 혼합물)을 제거하고 튜브를 비스듬히 잡고 혼합물을 적가하여 명확하게 볼 수 있는 상 분리를 만들어 새로운 500μL SCS 부분 표본에 조심스럽게 층을 그립니다( 그림 1A 참조). 튜브를 조심스럽게 닫고 상 분리를 방해하지 않고 얼음 위에 다시 놓습니다. 두 번째 900μL 현탁액과 새로운 SCS 부분 표본으로 3.1.2-3.1.4단계를 반복하여 그래디언트 원심분리를 위한 상 분리가 명확하게 보이는 샘플당 2개의 2mL 튜브를 갖습니다. 튜브를 사전 냉각된 원심분리기에 조심스럽게 넣고 4°C에서 15분 동안 13,000 x g 으로 회전합니다. 그 동안, NSR의 분취액에 RNase 억제제를 첨가하여 표 4에 기재된 NSR을 준비한다. 샘플당 1mL의 NSR을 준비합니다.참고: 이 시점에서 단일 세포 유전자 발현 시약 겔 비드를 -80°C 냉동고에서 제거하여 실온(RT)과 평형을 이룰 수 있으며 템플릿 스위치 올리고는 낮은 TE 버퍼에 재현탁될 수 있습니다. 원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 두 튜브에서 상층액을 제거하고 제조업체의 권장 사항에 따라 펠릿을 50μL의 얼음처럼 차가운 NSR에 조심스럽게 재현탁합니다. 동일한 샘플의 펠릿 2개를 새 1.5mL 튜브에 모으고 얼음처럼 차가운 NSR 900μL를 총 부피 1mL에 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞습니다. 스윙 버켓 로터 원심분리기를 사용하여 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 샘플을 원심분리합니다.알림: 특히 핵 수율이 낮을 것으로 예상되거나 소량의 조직으로 시작할 때 핵 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. 그 동안 표 5에 설명된 대로 0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.2U/μL RNase 억제제와 함께 1x PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)의 샘플당 500μL를 준비합니다. 펠릿을 버리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 위에서 준비한 대로 100μL의 PBS 용액(0.2U/μL에서 1x PBS + 0.04% BSA + RNase 억제제)에 펠릿을 재현탁시킵니다.참고: 작은 조직 샘플의 경우 핵 농도가 낮을 수 있으므로 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 충분히 높은 농도를 보장하기 위해 펠릿을 50μL의 PBS 용액에만 재현탁시키는 것이 좋습니다. 4단계로 바로 진행합니다. 실리카 콜로이드 그래디언트 클린업참고: 뇌 조직의 경우, 실리카 콜로이드 그래디언트는 핵 현탁액에서 미엘린과 파편을 제거하는 데 자당 그래디언트보다 더 적합합니다. 모든 세척 단계는 RNA 분해를 최소화하기 위해 얼음 위에서 수행됩니다. 버퍼와 튜브, 원심분리기는 사전 냉각되어야 합니다. 모든 재현탁 및 혼합 단계는 볼텍싱이 핵의 품질과 무결성을 손상시킬 수 있으므로 신중한 피펫팅으로만 수행됩니다.피펫 팁으로 분리기 카트리지의 둥근 호일을 조심스럽게 뚫습니다. 카트리지에서 핵 현탁액을 제거하고 5mL 튜브에 추가합니다. 사전 냉각된 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 500 x g 의 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 얼음처럼 차가운 18% 실리카 콜로이드 용액 1mL에 재현탁시킵니다. 18% 실리카 콜로이드 용액 2mL를 추가하여 총 부피가 3mL가 되도록 하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 브레이크를 끈 상태에서 스윙 버켓 로터에서 4°C에서 5분 동안 700 x g 의 샘플을 원심분리합니다. 그 동안, NSR의 분취액에 RNase 억제제를 첨가하여 표 4 에 기재된 NSR을 준비한다. 샘플당 1mL의 NSR을 준비합니다.참고: 이 시점에서 단일 세포 유전자 발현 시약 겔 비드를 -80°C 냉동고에서 제거하여 RT와 평형을 이루고 템플릿 스위치 올리고를 낮은 TE 버퍼에 재현탁시킬 수 있습니다. 위에 떠 있는 미엘린층을 방해하지 않고 원심분리기에서 샘플을 조심스럽게 제거합니다. 먼저 상단에서 미엘린 층을 제거하고 버립니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 전체 상층액을 조심스럽게 제거합니다.참고: 미엘린층은 1mL 피펫 팁에 멸균 보푸라기가 없는 물티슈를 감싸 1-2mL의 상층액과 함께 미엘린층을 흡인하여 쉽게 제거할 수 있습니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 펠릿을 얼음처럼 차가운 NSR 1mL에 재현탁시킵니다. 스윙 버켓 로터가 있는 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 샘플을 원심분리합니다.알림: 특히 핵 수율이 낮을 것으로 예상되거나 소량의 조직으로 시작할 때 핵 손실을 최소화하기 위해 스윙 버킷 로터를 사용하는 것이 좋습니다. 그 동안 표 5에 설명된 대로 0.04% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.2U/μL RNase 억제제와 함께 1x PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)의 샘플당 500μL를 준비합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 위에서 준비한 대로 100μL의 PBS 용액(0.2U/μL에서 1x PBS + 0.04% BSA + RNase 억제제)에 샘플을 재현탁시킵니다.참고: 작은 조직 샘플의 경우 핵 농도가 낮을 수 있으므로 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 충분히 높은 농도를 보장하기 위해 펠릿을 50μL의 PBS 용액에만 재현탁시키는 것이 좋습니다. 4. 카운팅 계수할 각 샘플에 대해 10μL의 핵 현탁액을 20μL의 PBS 용액에 희석하여 1:3 희석을 얻습니다. 계수를 위해 25μL의 요오드화 프로피듐(PI) 염색 용액을 형광 카운터 계수판의 혼합 웰에 추가합니다. 희석된 핵 현탁액 25μL를 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 50μL 염색된 샘플을 혼합 웰에서 로딩 웰로 옮깁니다. 셀 카운터에 계수 플레이트를 놓고 계수를 시작합니다.알림: 핵 수는 700ms의 노출 시간으로 적색 형광 채널에서 가져옵니다. 이 채널은 현미경으로 Neubauer Chamber 및 Trypan Blue 염색을 사용한 수동 계수와 교차 비교하여 정확한 핵 계수를 얻을 수 있도록 최적화되었습니다. 고농도에서는 핵이 서로 매우 가깝기 때문에 소프트웨어가 핵을 분리하기가 어렵습니다. 이 경우 적절한 희석액으로 샘플을 계수하는 것이 좋습니다. 핵의 무결성과 청결도는 명시야 이미지 또는 현미경으로 평가할 수 있습니다. PBS(1x PBS + 0.04% BSA + RNase inhibitor at 0.2 U/μL)로 샘플을 단일 핵 RNA 염기서열분석을 위해 원하는 농도로 희석합니다.참고: 700-1,200 nuclei/μL 사이의 농도는 단일 핵 RNA 염기서열분석에 최적인 것으로 간주됩니다. 700 nuclei/μL와 같은 낮은 세포 농도는 주변 RNA의 배경 오염을 감소시킬 수 있습니다. 5. 도서관 준비 샘플당 8000-10,000개의 핵 회수를 목표로 하는 제조업체의 프로토콜을 사용하여 단일 세포 유전자 발현 시약으로 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 수행합니다. 6. 시퀀싱 paired-end, dual indexing을 사용하여 원하는 염기서열분석 깊이로 라이브러리를 시퀀싱하고 Read 1: 28 cycles, i7 Index: 10 cycles, i5 Index: 10 cycles 및 Read 2: 90 cycles를 읽습니다.