Tracciamento de novo dei lipidi mediante marcatura isotopica stabile LC-TIMS-TOF MS/MS

Nell’analisi dei dati lipidici, la marcatura degli isotopi stabili (SIL) è un metodo efficace per valutare le vie metaboliche negli organismi viventi. In questo metodo, gli atomi all’interno di un analita sono sostituiti da isotopi stabili contenenti ¹³C o ²H. Questi isotopi sono ulteriormente incorporati nei precursori, che vengono successivamente incorporati negli acidi grassi, etichettando le aree in cui risiedono. Con questi isotopi, si è in grado di identificare la distribuzione e il metabolismo dei lipidi, in quanto contrasteranno con il fondo non marcato¹. Le comuni piattaforme di spettrometria di massa non sono in grado di distinguere il segnale proveniente dalle molecole endogene². Il successo di SIL richiede l’uso di strumenti analitici ad altissima risoluzione. La cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di mobilità ionica intrappolata ad alta risoluzione-frammentazione sequenziale ad accumulo parallelo-spettrometria di massa tandem a tempo di volo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) consente la separazione di specie marcate e non marcate². Il vantaggio dell’analisi LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS è che il segnale MS può essere filtrato in base al tempo di ritenzione (RT) e alla mobilità, riducendo così le potenziali interferenze delle molecole endogene, nonché la quantificazione e la separazione di tutte le specie desiderate². Nella TIMS, uno ione viene prima tenuto fermo contro una fase gas-mobile e successivamente rilasciato in base alla sua mobilità. Ciò fornisce mobilogrammi ad alta risoluzione pur operando a una tensione inferiore rispetto alla precedente strumentazione IMS³. I mobilogrammi sono grafici della massa da caricare rispetto al tempo di deriva che possono essere utilizzati per distinguere tra i composti in base al loro tempo di deriva e alla quantità di sovrapposizione⁴.

Utilizzando una tecnica PASEF aggiuntiva, la velocità di sequenziamento viene notevolmente aumentata senza sacrificare la sensibilità⁵. La teoria PASEF prevede l’accumulo di ioni seguito dal loro rilascio sequenziale nell’ordine della loro mobilità. Questo viene fatto accumulando ioni in parallelo all’allineamento della loro mobilità. L’accumulo in questo modo impedisce la perdita di ioni. Inoltre, la selezione degli ioni precursori avviene contemporaneamente all’accumulo e al rilascio degli ioni. Con questo metodo, PASEF seleziona più precursori in serie durante ogni scansione TIMS, piuttosto che i singoli precursori per scansione tipici di uno strumento TIMS che non utilizza PASEF. Quando gli ioni precursori vengono accumulati contemporaneamente e rilasciati in picchi di 2 ms all’interno di una scansione TIMS di circa 100 ms per fotogramma, il segnale viene amplificato di oltre un ordine di grandezza, aumentando così il rapporto segnale/rumore³. L’aggiunta di PASEF al TIMS aumenta l’efficienza dell’MS/MS. Poiché il TIMS-PASEF è accoppiato con MS/MS, è possibile una frammentazione più efficiente. A differenza del rilevamento MS/MS convenzionale, il segnale del precursore viene compresso dal TIMS-PASEF e gli ioni frammento vengono rilevati contemporaneamente al tempo di eluizione TIMS e alla posizione di mobilità ionica del precursore³.

Quando si acquisiscono dati da uno spettrometro di massa, ci sono opzioni nella modalità di scansione desiderata. L’acquisizione dipendente dai dati (DDA) seleziona gli ioni precursori dalla scansione MS1 in base alla loro abbondanza, prima di frammentarli ed eseguire la scansione MS2. Questa modalità di scansione frammenta il maggior numero possibile di precursori. L’approccio DDA è mirato e i risultati dipenderanno dalla selezione ionica³. Tuttavia, DDA-PASEF ha spesso problemi nella riproducibilità tra le repliche. Sebbene DDA sia un ottimo strumento in un’analisi mirata, le miscele complesse hanno maggiori difficoltà nell’acquisizione dei dati⁶. Questo perché solo una piccola quantità di ioni può essere monitorata contemporaneamente³. L’acquisizione indipendente dai dati (DIA) è un metodo in cui le finestre preselezionate di m/z sono frammentate indipendentemente dalla loro intensità e tutte vengono scansionate entro l’intervallo⁷. Con questa modalità di scansione, intere nuvole di ioni vengono trasmesse dall’IMS allo spettrometro di massa³. Negli studi di proteomica ciò si traduce in una maggiore quantità di proteine quantificate in un arco di tempo più breve rispetto alla DDA. Inoltre, la DIA perde meno valori m/z rispetto alla DDA. Pertanto, questa alternativa ha mostrato grandi miglioramenti nella riproducibilità dei dati nel rapporto segnale/rumore e una migliore quantificazione rispetto alla DDA. In questo lavoro, il nostro obiettivo è quello di implementare la DIA secondo il metodo riportato da Tose et ^al.2. Abbiamo migliorato la riproducibilità e l’intensità dei segnali, fornendo ulteriori e più conclusive informazioni sulla mobilizzazione, distribuzione e metabolismo dei lipidi SIL in campioni biologici sfruttando l’acquisizione di DDA e DIA.