Cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa co-coltivate con glia mista primaria per ridurre l'infiammazione indotta da prioni
Summary
Le cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) hanno potenti proprietà immunomodulatorie utili per il trattamento delle malattie associate all’infiammazione. Dimostriamo come isolare e coltivare le AdMSC murine e la glia mista primaria, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni antinfiammatori e i fattori di crescita, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia primaria mista infettata da prioni.
Abstract
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono potenti regolatori dell’infiammazione attraverso la produzione di citochine antinfiammatorie, chemochine e fattori di crescita. Queste cellule mostrano la capacità di regolare la neuroinfiammazione nel contesto di malattie neurodegenerative come la malattia da prioni e altri disturbi del misfolding proteico. Le malattie da prioni possono essere sporadiche, acquisite o genetiche; Possono derivare dal ripiegamento errato e dall’aggregazione della proteina prionica nel cervello. Queste malattie sono invariabilmente fatali, senza trattamenti disponibili.
Uno dei primi segni di malattia è l’attivazione degli astrociti e della microglia e l’infiammazione associata, che si verifica prima dell’aggregazione prionica rilevabile e della perdita neuronale; pertanto, le proprietà antinfiammatorie e regolatorie delle MSC possono essere sfruttate per trattare l’astrogliosi nella malattia da prioni. Recentemente, abbiamo dimostrato che le MSC di derivazione adiposa (AdMSCs) co-coltivate con cellule BV2 o glia mista primaria riducono l’infiammazione indotta dai prioni attraverso la segnalazione paracrina. Questo articolo descrive un trattamento affidabile che utilizza AdMSC stimolate per ridurre l’infiammazione indotta dai prioni.
Una popolazione eterozigote di AdMSC può essere facilmente isolata dal tessuto adiposo murino ed espansa in coltura. La stimolazione di queste cellule con citochine infiammatorie migliora la loro capacità sia di migrare verso l’omogenato cerebrale infetto da prioni che di produrre modulatori antinfiammatori in risposta. Insieme, queste tecniche possono essere utilizzate per studiare il potenziale terapeutico delle MSC sull’infezione da prioni e possono essere adattate per altre malattie neuroinfiammatorie e di misfolding proteico.
Introduction
L’infiammazione gliale svolge un ruolo chiave in una varietà di malattie neurodegenerative, tra cui il Parkinson, l’Alzheimer e la malattia da prioni. Sebbene l’aggregazione proteica anomala sia attribuita a gran parte della patogenesi della malattia e della neurodegenerazione, anche le cellule gliali svolgono un ruolo nell’esacerbare questo 1,2,3. Pertanto, mirare all’infiammazione indotta dalla glia è un approccio terapeutico promettente. Nella malattia da prioni, la proteina prionica cellulare (PrPC) si ripiega erroneamente nella proteina prionica associata alla malattia (PrPSc), che forma oligomeri e aggregati e interrompe l’omeostasi nel cervello 4,5,6.
Uno dei primi segni di malattia da prioni è una risposta infiammatoria da parte degli astrociti e della microglia. Gli studi che sopprimono questa risposta, sia attraverso la rimozione della microglia che la modifica degli astrociti, non hanno generalmente mostrato alcun miglioramento o peggioramento della patogenesi della malattia nei modelli animali 7,8,9. Modulare l’infiammazione gliale senza eliminarla è un’alternativa terapeutica intrigante.
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono diventate un trattamento per una varietà di malattie infiammatorie, grazie alla loro capacità di modulare l’infiammazione in modo paracrino 10,11. Hanno dimostrato la capacità di migrare verso i siti di infiammazione e rispondere alle molecole di segnalazione in questi ambienti secernendo molecole antinfiammatorie, fattori di crescita, microRNA e altro ancora 10,12,13. Abbiamo precedentemente dimostrato che le MSC derivate dal tessuto adiposo (denotate AdMSCs) sono in grado di migrare verso l’omogenato cerebrale infettato da prioni e rispondono a questo omogenato cerebrale sovraregolando l’espressione genica per citochine antinfiammatorie e fattori di crescita.
Inoltre, le AdMSCs possono ridurre l’espressione di geni associati al Nuclear Factor-kappa B (NF-κB), il dominio pirinico della famiglia dei recettori Nod-Like contenente 3 (NLRP3) e l’attivazione gliale, sia nella microglia BV2 che nella glia mista primaria 14. Qui, forniamo protocolli su come isolare sia le AdMSC che la glia mista primaria dai topi, stimolare le AdMSC a sovraregolare i geni modulatori, valutare la migrazione delle AdMSC e co-coltivare le AdMSC con glia infetta da prioni. Speriamo che queste procedure possano fornire una base per ulteriori indagini sul ruolo delle MSC nella regolazione dell’infiammazione indotta dalla glia nelle malattie neurodegenerative e in altre malattie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui dimostriamo un protocollo affidabile e relativamente poco costoso per valutare gli effetti delle cellule stromali mesenchimali di derivazione adiposa (AdMSC) nel ridurre l’infiammazione indotta da prioni in un modello di cellule gliali. Le AdMSC possono essere facilmente isolate ed espanse in coltura per l’uso in appena 1 settimana. Questo protocollo produce costantemente una popolazione eterologa di cellule che esprimono marcatori coerenti con quelli delle cellule stromali mesenchimali mediante immunofluorescenza e …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Lab Animal Resources per la loro zootecnia. Le nostre fonti di finanziamento per questo manoscritto includono il Boettcher Fund, il Murphy Turner Fund, il CSU College of Veterinary Medicine e il Biomedical Sciences College Research Council. La Figura 2A, la Figura 2C e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
Referenzen
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