Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo
Summary
Qui, descriviamo un metodo per alterare selettivamente le espressioni geniche nel plesso coroideo evitando qualsiasi impatto in altre aree cerebrali.
Abstract
Il plesso coroideo (ChP) funge da porta d’accesso critica per l’infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC) sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Recenti ricerche hanno dimostrato che la regolazione dell’attività di ChP può offrire protezione contro i disturbi del SNC. Tuttavia, studiare la funzione biologica del ChP senza influenzare altre regioni del cervello è impegnativo a causa della sua delicata struttura. Questo studio presenta un nuovo metodo per il knockdown genico nel tessuto ChP utilizzando virus adeno-associati (AAV) o proteina ricombinasi dell’enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre) costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT). I risultati dimostrano che dopo l’iniezione di AAV o CRE-TAT nel ventricolo laterale, la fluorescenza è stata concentrata esclusivamente nel ChP. Utilizzando questo approccio, lo studio ha abbattuto con successo il recettore dell’adenosina A2A (A 2AR) nel ChP utilizzando l’interferenza dell’RNA (RNAi) o Cre/locus dei sistemi X-overP1 (Cre/LoxP) e ha dimostrato che questo knockdown potrebbe alleviare la patologia dell’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questa tecnica può avere importanti implicazioni per la ricerca futura sul ruolo della ChP nei disturbi del SNC.
Introduction
Si è spesso pensato che il plesso coroideo (ChP) aiutasse a mantenere l’omeostasi funzionale del cervello secernendo liquido cerebrospinale (CSF) e fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)1,2. L’aumento della ricerca negli ultimi tre decenni ha rivelato che il ChP rappresenta un percorso distinto per l’infiltrazione delle cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC).
Le giunzioni strette (TJ) del ChP, composte da un epitelio ChP monostrato, mantengono l’omeostasi immunologica impedendo alle macromolecole e alle cellule immunitarie di entrare nel cervello3. Tuttavia, in determinate condizioni patologiche, il tessuto ChP rileva e risponde ai modelli molecolari associati al pericolo (DAMP) nel liquido cerebrospinale e nel sangue, portando a infiltrazioni immunitarie anomale e disfunzioni cerebrali 4,5. Nonostante il suo ruolo critico, le piccole dimensioni del ChP e la sua posizione unica nel cervello rendono difficile studiarne la funzione senza influenzare altre regioni cerebrali. Pertanto, manipolare l’espressione genica in modo specifico nel ChP è un approccio ideale per comprenderne la funzione.
Inizialmente, le linee transgeniche dell’enzima di ricombinazione della ciclizzazione (Cre), che esprimono Cre sotto il controllo di promotori specifici per i geni espressi nel ChP, sono state comunemente utilizzate per eliminare i geni bersaglio mediante l’ibridazione con i geni candidatifloxed 6,7,8. Ad esempio, il fattore di trascrizione Forkhead box J1 (FoxJ1) è espresso esclusivamente nell’epitelio ChP del cervello prenatale del topo7. Pertanto, la linea FoxJ1-Cre è stata spesso utilizzata per eliminare i geni situati nel ChP 6,9. Tuttavia, il successo di questa strategia dipende fortemente dalla specificità del promotore. Si scoprì gradualmente che il modello di espressione di FoxJ1 non era abbastanza distintivo, poiché FoxJ1 era presente anche nelle cellule epiteliali ciliate in altre parti del cervello e del sistema periferico7. Per superare questa limitazione, è stata eseguita un’iniezione intra-cerebroventricolare (ICV) di Cre ricombinasi per veicolare la ricombinasi nei ventricoli delle linee transgeniche floxate. Questa strategia ha mostrato un’elevata specificità, come evidenziato dalla presenza di fluorescenza tdTomato esclusivamente nel tessuto ChP10,11. Tuttavia, questo metodo è ancora limitato dalla disponibilità di linee di topi transgenici floxati. Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno impiegato l’iniezione ICV di virus adeno-associato (AAV) per ottenere il knockdown specifico per ChP o la sovraespressione dei geni bersaglio12,13. Una valutazione completa di diversi sierotipi di AAV per l’infezione da ChP ha rivelato che AAV2/5 e AAV2/8 mostrano forti capacità di infezione nel ChP, pur non infettando altre regioni cerebrali. Tuttavia, è stato riscontrato che AAV2/8 infetta l’ependima che circonda i ventricoli, mentre il gruppo AAV2/5 non ha mostrato alcuna infezione14. Questo metodo ha il vantaggio di superare i limiti dell’acquisizione di animali transgenici floxati.
Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per il knockdown genico nel ChP utilizzando due metodi: ICV di AAV2/5 che trasporta shRNA del recettore dell’adenosina A 2A (A 2AR) e proteina ricombinasi Cre costituita dalla sequenza TAT (CRE-TAT) ricombinasi per ottenere il knockdown specifico per ChP di A2A R. I risultati dello studio suggeriscono che abbattere A2AR nella ChP può alleviare l’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo dettagliato fornisce una guida utile per gli studi sulla funzione della ChP e per il knockdown specifico dei geni nella ChP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricerca ha presentato due approcci distinti per il knockdown mirato dei geni ChP. Il primo approccio prevedeva l’iniezione ICV di CRE-TAT, che contiene Cre ricombinasi, in topi flox A2AR/flox. Il secondo approccio ha comportato l’iniezione ICV di AAV2/5 trasportatore di shRNA di A2AR. Utilizzando queste due strategie, il lavoro ha ottenuto il knockdown selettivo di A 2A R all’interno del ChP ed è stato in grado di dimostrare gli effetti protettivi dell’inibizione della segnalazione di…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine il sostegno della National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31800903, assegnato a W. Zheng) e del Wenzhou Science and Technology Project (n. Y2020426, assegnato a Y. Y. Weng) per questo lavoro.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
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