Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns
Summary
Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.
Abstract
Drosophila-neurale Stammzellen (Neuroblasten, im Folgenden NBs) durchlaufen asymmetrische Teilungen, die den sich selbst erneuernden Neuroblasten regenerieren und gleichzeitig eine differenzierende Ganglienmutterzelle (GMC) bilden, die eine zusätzliche Teilung durchläuft, um zwei Neuronen oder Gliazellen entstehen zu lassen. Studien an NBs haben die molekularen Mechanismen aufgedeckt, die der Zellpolarität, der Spindelorientierung, der Selbsterneuerung neuraler Stammzellen und der Differenzierung zugrunde liegen. Diese asymmetrischen Zellteilungen sind durch Lebendzell-Bildgebung leicht zu beobachten, wodurch sich Larven-NBs ideal für die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik der asymmetrischen Zellteilung in lebendem Gewebe eignen. Bei richtiger Präparation und Abbildung in nährstoffangereichertem Medium teilen sich NBs im Explantatgehirn 12-20 Stunden lang robust. Die zuvor beschriebenen Methoden sind technisch schwierig und können für Neulinge auf diesem Gebiet eine Herausforderung darstellen. Hier wird ein Protokoll für die Präparation, Präparation, Montage und Bildgebung von lebenden Larvenexplantaten des dritten Stadiums unter Verwendung von Fettkörperpräparaten beschrieben. Es werden auch mögliche Probleme diskutiert und Beispiele für den Einsatz dieser Technik gegeben.
Introduction
Asymmetrische Zellteilung (ACD) ist der Prozess, bei dem subzelluläre Komponenten wie RNA, Proteine und Organellen ungleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden 1,2. Dieser Prozess ist häufig bei Stammzellen zu beobachten, die ACD durchlaufen, um Tochterzellen mit unterschiedlichen Entwicklungsschicksalen hervorzubringen. Drosophila NBs teilen sich asymmetrisch und erzeugen eine NB, die ihre Stammform beibehält, und eine Ganglienmutterzelle (GMC). Das GMC durchläuft weitere Teilungen, um differenzierende Neuronen oder Gliazellenzu erzeugen 3. Asymmetrisch teilende NBs sind in den sich entwickelnden Gehirnen von Larven des dritten Stadiums reichlich vorhanden, die mit Hilfe der Mikroskopie leicht beobachtet werden können. Im Larvenstadium des dritten Stadiums sind in jedem zentralen Hirnlappen etwa 100 NBsvorhanden 3,4,5,6.
Die asymmetrische Zellteilung ist ein hochdynamischer Prozess. Lebendzell-Bildgebungsprotokolle wurden verwendet, um die Dynamik der Zellpolarität 7,8,9,10, der Spindelorientierung 11,12,13, der Dynamik des Aktomyosin-Kortex14,15,16,17,18, der Mikrotubuli- und Zentrosombiologie 19,20 zu messen und zu quantifizieren,21,22,23,24,25,26,27 und Membran 10,28 und Chromatindynamik 29. Qualitative und quantitative Beschreibungen von ACD basieren auf robusten Methoden und Protokollen, um NBs in intakten lebenden Gehirnen abzubilden. Das folgende Protokoll beschreibt Methoden zur Präparation, Sektion und Bildgebung von Larvengehirnen im dritten Stadium für die Bildgebung lebender Zellen in vivo unter Verwendung von zwei verschiedenen Montageansätzen. Diese Methoden eignen sich am besten für Forscher, die sich für die raumzeitliche Dynamik von Stammzellteilungen sowie für Teilungen in anderen Gehirnzellen interessieren, da sie kurz- und langfristige Beobachtungen zellulärer Ereignisse ermöglichen. Darüber hinaus sind diese Techniken für Neulinge auf diesem Gebiet leicht zugänglich. Wir demonstrieren die Effektivität und Anpassungsfähigkeit dieses Ansatzes mit Larvenhirnen, die fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli und kortikale Fusionsproteine exprimieren. Darüber hinaus diskutieren wir Analysemethoden und Überlegungen zur Anwendung in anderen Studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz für die Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven . Das hier beschriebene Protokoll erlaubt es, Explantatgehirne für 12-20 Stunden unter den richtigen experimentellen Bedingungen zu beobachten. Besonderes Augenmerk muss auf die Vorbereitung der Proben und das Design der gewünschten Experimente gelegt werden. Wie bereits erwähnt, ist einer der kritischsten Faktoren, der die Qualität des präparierten Gewebes bestimmt, die Gesundheit …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wird durch R35GM148160 (C. C.) und einen National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S) unterstützt
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
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