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Biologie

Siebung von Fruchtfleisch zum Nachweis unreifer Tephritiden-Fruchtfliegen auf dem Feld

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65501
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1Animal Plant Health Inspection Service (APHIS), Plant Protection and Quarantine (PPQ), Science and Technology (S&T) Miami,United States Department of Agriculture (USDA), 2Division of Plant Industry,Florida Department of Agriculture and Consumer Services, 3APHIS, PPQ, S&T,USDA, 4IFAS, Tropical Research and Education Center,University of Florida, 5Agricultural Research Service (ARS), Pacific Basin Agricultural Research Center,USDA, 6APHIS, PPQ, Field Operations,USDA, 7ARS, Subtropical Horticulture Research Station,USDA

Summary

Die verstärkte Erkennung von unreifen Tephritiden-Fruchtfliegen im Feld kann rechtzeitig Anstrengungen zur Beseitigung von Populationen dieser zerstörerischen Schädlinge auslösen. Die Erkennung von Larven im späten Stadium ist schneller und genauer, wenn die Wirtsfrüchte in einem Beutel zerdrückt und das Fruchtfleisch durch eine Reihe von Sieben geführt werden, als beim manuellen Schneiden und bei der visuellen Inspektion.

Abstract

Fruchtfliegen aus der Familie der Tephritidae gehören zu den zerstörerischsten und invasivsten landwirtschaftlichen Schädlingen der Welt. Viele Länder führen teure Ausrottungsprogramme durch, um beginnende Populationen zu eliminieren. Während der Ausrottungsprogramme werden konzertierte Anstrengungen unternommen, um Larven zu erkennen, da dies stark auf eine Brutpopulation hinweist und hilft, die räumliche Ausdehnung des Befalls zu bestimmen. Die Erkennung unreifer Lebensstadien löst zusätzliche Kontroll- und Regulierungsmaßnahmen aus, um eine weitere Ausbreitung des Schädlings einzudämmen und zu verhindern. Traditionell erfolgt die Larvenerkennung durch das Schneiden einzelner Wirtsfrüchte und deren visuelle Untersuchung. Diese Methode ist arbeitsintensiv, da nur eine begrenzte Anzahl von Früchten verarbeitet werden kann und die Wahrscheinlichkeit, eine Larve zu übersehen, hoch ist. Es wurde eine Extraktionstechnik getestet, die i) das Zerdrücken von Wirtsfrüchten in einer Plastiktüte, ii) das Abseihen von Fruchtfleisch durch eine Reihe von Sieben, iii) das Einlegen von zurückgehaltenem Fruchtfleisch in eine braune Zuckerwasserlösung und iv) das Sammeln von Larven, die an die Oberfläche schwimmen, kombiniert. Die Methode wurde in Florida mit im Feld gesammelter Guave evaluiert, die auf natürliche Weise von Anastrepha suspensa befallen war. Um niedrige Populationen nachzuahmen, die repräsentativer für ein Programm zur Ausrottung von Fruchtfliegen sind, wurden Mangos und Papaya auf Hawaii mit einer bekannten, geringen Anzahl von Bactrocera dorsalis-Larven befallen. Die Anwendbarkeit der Methode wurde im Freiland an Guave getestet, die von Natur aus von B. dorsalis befallen war, um die Methode unter Bedingungen zu bewerten, denen die Arbeiter während eines Notfallprogramms für Fruchtfliegen ausgesetzt waren. Sowohl in Feld- als auch in Laborversuchen war das Zerkleinern und Sieben des Fruchtfleisches effizienter (erforderte weniger Zeit) und empfindlicher (es wurden mehr Larven gefunden) als das Schneiden von Früchten. Das Aufschwimmen des Fruchtfleisches in brauner Zuckerwasserlösung half bei der Erkennung früherer Larven im Stadium. Das Zerkleinern und Sieben von Fruchtfleisch wichtiger Tephritidenwirte kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, Larven während Notfallprogrammen zu entdecken.

Introduction

Tephritiden-Fruchtfliegen gehören zu den zerstörerischsten landwirtschaftlichen Schädlingen, wobei die Gattungen Anastrepha, Bactrocera und Ceratitis das größte Risiko darstellen1. Viele Gebiete sind einem hohen Risiko für die Ansiedlung exotischer Fruchtfliegen ausgesetzt, basierend auf 1) historischen Einbrüchen und damit verbundenen Abgrenzungs- und Ausrottungsprogrammen, 2) der hohen Ankunftsrate von Fruchtfliegen-Wirtsmaterial an den Einreisehäfen und 3) klimatischen Bedingungen, die für die Etablierung von Fortpflanzungspopulationen günstig sind. Im Bundesstaat Kalifornien kommt es jährlich zu mehreren Einbrüchen und Nachweisen von Tephritiden2. Im letzten Jahrhundert gab es weltweit mehr als 200 Einfälle und Ausrottungsprogramme gegen Tephritiden, und dies hat sich in denletzten Jahrzehnten erheblich beschleunigt 3. Obwohl die überwiegende Mehrheit dieser Programme bei der Ausrottung der eindringenden Fruchtfliege erfolgreich ist3,4, bleibt die wirtschaftliche und ökologische Belastung durch diese Invasionen hoch, und die Möglichkeit einer Etablierung ist immer noch vorhanden; Ein aktuelles katastrophales Beispiel ist die Infektion von Bactrocera dorsalis auf dem afrikanischen Kontinent5.

Bei Notfall-Fruchtfliegenprogrammen werden konzertierte Anstrengungen unternommen, um Brutpopulationen der eindringenden Arten zu erkennen und zu kontrollieren. Zum Beispiel reagiert der Bundesstaat Florida auf das Eindringen von Tephritiden, indem er Bodentränken (unter der Tropflinie fruchttragender Wirtspflanzen) ausbringt und Wirtsfrüchte in einem Radius von 200 m um Standorte entfernt, an denen begattete Weibchen und/oder Larven zu findensind 6. Diese Aktionen und Taktiken dienen dazu, Larven und Puppen im Boden abzutöten und alle Eier und Larven von Früchten in der Umgebung zu entfernen. Bei einigen Tilgungsprogrammen wird eine beträchtliche Menge an Wirtsfrüchten entfernt. Im Jahr 2015 wurden während des Ausrottungsprogramms von B. dorsalis in Florida über 100.000 kg Obst vernichtet6. Die wirtschaftlichen Verluste für die Erzeuger und die damit verbundenen Industrien allein im Quarantänegebiet wurden auf über 10,7 Millionen US-Dollar geschätzt7.

Um Tephritidenlarven in den Quarantänegebieten zu finden, sammelt ein kleines Team von Entomologen Wirtsfrüchte in einem Radius von 200 m um ein Erkennungsgebiet für weibliche Fliegen und schneidet jede Frucht und untersucht sie visuell auf Larven6. Mit begrenzten personellen Ressourcen und Hunderten von möglichen Gastgebern wird die Aufgabe schwierig, insbesondere in den Bereichen, in denen die Pflanzenvielfalt sowohl in gewerblichen Produktionsbereichen als auch in Wohnhöfen hoch ist. Außerdem können Larven beim Schneiden von Wirtsfrüchten übersehen werden. In einer Studie, in der das Schneiden von Früchten an den Eintrittshäfen untersucht wurde, wurde festgestellt, dass das Schneiden von Früchten beim Nachweis von A. suspensa nicht so effektiv ist wie das mehrwöchige Halten der befallenen Früchte und das Zählen der Larven und Puppen, die im Verpuppungssubstrat gefunden wurden8.

Es gibt Alternativen zum Obstschneiden, um einen Befall zu erkennen 9,10,11,12,13. Zum Beispiel sind eine Floating-Methode mit braunem Zucker und eine Heißwassermethode anerkannte Verfahren, die zum Nachweis von westlichen Kirschfruchtfliegen in geernteten Kirschen verwendet werden 9,10. Bei der Methode des braunen Zuckers werden zerkleinerte Früchte in eine Zuckerwasserlösung gelegt und Larven gesammelt, die nach oben schwimmen. Die Flotationsmethode für braunen Zucker wurde speziell entwickelt, um die regulatorischen Vorschriften für exportierte Kirschen zu erfüllen, die von den Verpackungsbetrieben verlangen, auf Quarantäne-Fruchtfliegenschädlinge zu überwachen. Es gibt auch ein genehmigtes US-kanadisches Heidelbeer-Zertifizierungsprogramm, das das Aufschwimmen von braunem Zuckerwasser, das Aufschwimmen von Salzwasser oder das Kochen zur Unterstützung der Phytosanitationumfasst 14. Bei der Prüfung der Genauigkeit der Zucker- und Heißwasserflotation verwendeten die Forscher die Siebmethode, um zu bestimmen, wie viele Larven übersehen werden 9,10,11,12,13. Eine Studie zeigte, dass das Mischen von zerkleinerten Blaubeeren in einer Salzlösung und das Filtern der Lösung durch einen wiederverwendbaren Kaffeefilter beim Nachweis von Drosophila suzukii-Larven viermal besser war als die visuelle Inspektion der Oberfläche von Salz- und Zuckerlösungen14. Zusätzlich wurde die Gaschromatographie zum Nachweis von A. suspensa-Larven in Zitrusfrüchteneingesetzt 15. Diese Ansätze wurden nicht auf ihre Anwendbarkeit in Feldstudien getestet.

Unser Ziel war es, eine Methode zu entwickeln und zu testen, um Tephritidenlarven im Freiland mit Hilfe von Sieben und Zuckerwasser-Flotation zu finden. Diese Methode ermöglicht die effizientere Erkennung von unreifen Fruchtfliegen als die traditionelle Methode zum Schneiden von Früchten und unterstützt die rechtzeitige Kontrolle von Brutpopulationen während der Ausrottungsprogramme von Fruchtfliegen.

Protocol

1. Auswahl der Früchte Bestimmen Sie, welche Früchte in dem zu vermessenden Gebiet verfügbar sind. Wählen Sie die Wirtsfrucht basierend auf der Liste der bekannten Wirte für die Zieltephritidenart aus. Wählen Sie weichfleischige, reife Früchte wie Mangos, Papaya und Guave. Unreife oder hartfleischige Früchte, wie z. B. tropische Mandeln, sollten mit einer anderen Methode untersucht werden, z. B. mit dem Schneiden von Früchten. Wählen Sie abgefallene, überreife Früchte oder reife Früchte an Bäumen aus, die Anzeichen von Schäden, Eiablagenarben und weiche Stellen aufweisen. Verarbeiten Sie ca. 2 l Früchte auf einmal (z. B. 5 Guaven oder 5 mittelgroße Mangos sind ausreichende Proben für diese Methode). Die Anzahl der Früchte, die auf einmal verarbeitet werden können, hängt von der Größe der Früchte ab (Abbildung 1A). 2. Zerkleinern Schneiden Sie die Früchte in große Stücke und legen Sie sie in einen 4-Liter-Aufbewahrungsbeutel mit Reißverschluss (Abbildung 1B). Geben Sie Wasser in den Beutel, bis das Wasser die gehackten Früchte um 25-50 mm bedeckt (Abbildung 1C). Drücken Sie die Früchte vorsichtig von Hand aus, bis sich das gesamte Fruchtfleisch von der Schale gelöst hat und eine glatte Konsistenz hat (d. h. keine großen Stücke) (Abbildung 1D). 3. Sieben für die späte Entnahme im Stadium Stapeln Sie die Siebe. Verwenden Sie große Siebe (457 mm Durchmesser) für die Verarbeitung großer Mengen von Früchten (~ 5 Früchte auf einmal) und kleinere Siebe (305 mm Durchmesser) für einzelne Früchte oder kleinere Proben (< 5 Früchte). Stapeln Sie das Sieb mit einem großmaschigen Sieb (Nr. 8; 2,36 mm) auf ein kleines Sieb (Nr. 20; 0,85 mm). Für die Detektion von frühen Stadien wird ein drittes Sieb (Nr. 45; 0,35 mm) auf den Boden des Stapels gelegt (Abbildung 1E). Gießen Sie das Fruchtfleisch in das obere Sieb (Abbildung 1F). Waschen Sie das Fruchtfleisch gründlich durch den Siebstapel mit Wasser aus einem Wasserhahn, einem Schlauch oder einer Flasche, bis das feine Fruchtfleisch durch die Siebe geflossen ist (Abbildung 1G). Scannen Sie die oberen Siebe visuell nach Larven im späten Stadium, die möglicherweise mit der Schale oder großen Fruchtstücken zurückgeblieben sind (Abbildung 1H). Untersuchen Sie das zweite Sieb sorgfältig auf Larven im späten Stadium. Bei großen Mengen an feinem Fruchtfleisch kann ein zusätzliches Spülen erforderlich sein. Sammeln Sie die Larven mit einer Larvenzange aus den Sieben und legen Sie sie in Fläschchen mit 70% EtOH. 4. Sugar Floatation für die frühe Instar-Entnahme Mischen Sie die Zuckerlösung vor, indem Sie 453 g (1 Schachtel) dunkelbraunen Zucker in 2 l Leitungswasser auflösen, was einen Brix-Wert von 19°10 ergibt. Waschen Sie das Fruchtfleisch von den feinmaschigen Sieben (z. B. Nr. 20 und Nr. 45) bis zum Rand des Siebes mit Leitungswasser und geben Sie das Material dann in einen Kunststofftopf (11 L). Fügen Sie die braune Zuckerlösung hinzu, bis sie das Fruchtfleisch um 25-50 mm bedeckt, und fügen Sie 2 Tropfen Antischaummittel hinzu. Lassen Sie das Fruchtfleisch ca. 5 Minuten in der braunen Zuckerlösung ruhen. Sammeln Sie Larven, die an der Oberfläche der Lösung schwimmen, mit einer Larvenzange in Fläschchen mit 70 % EtOH. 5. Kuration der Larven Beschriften Sie eine Durchstechflasche mit dem Entnahmeort, dem Datum, der Obstsorte und dem Sammler zur späteren Untersuchung und Identifizierung.

Representative Results

Früh- und Spätstadium-Extraktion von Anastrepha suspensa aus FeldfrüchtenIn diesem Experiment haben wir das Schneiden von Früchten und die Methoden des Zerkleinerns, Siebens und Schwimmens (MSF) in Bezug auf den Anteil der nachgewiesenen Larven und die durchschnittliche Zeit, die benötigt wird, um sie zu erkennen, verglichen. Guaven, die stark von den Larven von Anastrepha suspensa befallen sind, wurden von einer Pflanze an der University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, Tropical Research and Education Center, Homestead, FL, gesammelt. Die Früchte wurden nach dem Zufallsprinzip in 5er-Gruppen sortiert und 1 von 2 Larvenextraktionsmethoden zugeordnet: 1) Handschneiden oder 2) der MSF-Methode. Die Zeit, um alle mit bloßem Auge sichtbaren Larven mit jeder Extraktionsmethode zu sammeln, wurde aufgezeichnet. Die Handschneidemethode folgte der Methode, die derzeit in einem Tilgungsprogramm verwendet wird. Jedem der 5 Arbeiter (n=5) wurden 5 Früchte zugewiesen, um nach allen Stadien der Larve zu suchen, indem sie die Früchte in kleinere Stücke schnitten und das Fruchtfleisch visuell inspizierten. Um festzustellen, ob Larven bei der Sichtprüfung übersehen wurden, wurden die handgeschnittenen Fruchtstücke mit einem Präpariermikroskop (10x) erneut inspiziert. Für die MSF-Methode wurden 5 Früchte in große Stücke (50-80 cm) geschnitten, in Druckverschlussbeutel gelegt und vorsichtig von Hand zusammengedrückt, bis sich das gesamte Fruchtfleisch von der Schale gelöst hatte und das Fruchtfleisch eine glatte Konsistenz hatte (d. h. keine großen Stücke). Die zerdrückten Früchte wurden durch eine Reihe von großen (45,7 cm) Messingsieben abgeseiht. Oben wurde das größte Sieb (Nr. 8) gestapelt, gefolgt von einer Nummer Nr. 20 und einem Sieb Nr. 45. Die mit dieser Behandlung betrauten Mitarbeiter wuschen den Zellstoff mit Wasser aus einem Schlauch, der an einen Waschbeckenhahn angeschlossen war, durch das Netz. Die Larven im späten Stadium waren in den Sieben sichtbar. Die kleineren Stadien waren mit Fruchtfleisch vermischt, so dass sie schwer zu sehen und zu entfernen waren. Daher wurde das Fruchtfleisch-Larven-Gemisch aus den Sieben in Eimer mit 1 l brauner Zuckerwasserlösung gegeben. Die Larven schwammen sofort an die Oberfläche. Die Lösung wurde vorsichtig gerührt, und nach 5 Minuten wurden die Larven aus den Eimern genommen und gezählt. Die Zeit, um die Früchte zu verarbeiten, war eine Kombination aus Zerdrücken, Sieben und Entfernen der Larven aus der Zuckerwasserlösung. Die Daten für die Anzahl der Larven, die durch die Handschneide- oder Sieb- und Flotationsmethoden gefunden wurden, wurden mit dem nicht-parametrischen Kruskal-Wallis-Test analysiert (p = 0,05)16. Die MSF-Methode lieferte eine größere Anzahl von Larven (Abbildung 2A) und mehr Larven pro Minute (Abbildung 2B) als der Handschnitt. Obwohl der Nachweis der verschiedenen Stadien in dieser Studie nicht quantifiziert wurde, beobachteten wir, dass alle Stadien (erstes, zweites und drittes) mit Sieben gefunden wurden, während nur spätere Stadien (zweites und drittes) durch Handschneiden gefunden wurden. Als die zuvor geschnittenen und visuell inspizierten Proben erneut mit einem Präpariermikroskop inspiziert wurden, wurden 40 % der Larven im späten Stadium, die die Früchte befielen, übersehen. Frühere Stadien wurden jedoch vor allem bei der erneuten Inspektion gefunden. Dieses Experiment zeigte, dass die Anwendung der MSF-Methode effektiver und effizienter ist, um Larven in stark befallenen Früchten zu finden. Früchte, die mit einer geringeren Anzahl von Larven befallen sind, sind jedoch eher in einem Ausrottungsprogramm anzutreffen, bei dem die eindringenden Arten sehr selten wären. Daher haben wir eine Laborstudie durchgeführt, in der die Wirtsfrucht mit einer bekannten, geringen Anzahl von Larven befallen war. Manueller Befall von Mango und Papaya zur Simulation eines geringen Befalls mit Bactrocera dorsalisIn diesem Experiment wurden die Fruchtschnitt- und die MSF-Methode hinsichtlich des Anteils der nachgewiesenen Larven und der Zeit, die benötigt wurde, um sie zu erkennen, verglichen, wenn der Befall relativ gering war. Der manuelle Befall wurde als experimentelles Instrument verwendet, um die Wirksamkeit der einzelnen Methoden zu bewerten, da die Anzahl der vorhandenen Larven mit Sicherheit bekannt war. Mit einem Korkbohrer (1,0 cm Durchmesser) wurden 5 Löcher in einzelne Mango- und Papayafrüchte gebohrt, die frei von Fruchtfliegenlarven waren. Eine einzelne B. dorsalis-Larve im späten zweiten bis frühen dritten Stadium wurde in jedes der 5 Löcher einer Untergruppe der Frucht eingesetzt. Die Löcher wurden mit dem aus der Frucht gebohrten Stück verschlossen und die restlichen Früchte wurden ohne Larveneinsatz verschlossen, um den manuellen Befall visuell zu simulieren. Die Früchte wurden 48 h lang bei 27 °C gehalten, um die Larvenentwicklung zu ermöglichen. Das Experiment wurde im ARS-Labor in Hilo, Hawaii Island (n = 5 Arbeiter) und im APHIS-PPQ-Labor auf Oahu Island, Hawaii (n = 4 Arbeiter) durchgeführt. Für den Fruchtschnitt erhielt jeder Arbeiter 5 Mangos (1 mit 1 Larve befallen und 4 nicht befallen) und 4 Papayas (eine befallen und 3 nicht befallen). Ein Arbeiter schnitt jede Frucht einzeln in immer kleinere Stücke und untersuchte das Fruchtfleisch kontinuierlich auf unreife Fruchtfliegen. Die Suche wurde gestoppt, als die Pulpa gründlich inspiziert wurde. Die Gesamtzahl der gefundenen Larven und die Zeit, die jeder Arbeiter aufwendete, um alle Früchte durch Schneiden zu verarbeiten, wurden aufgezeichnet (Abbildung 3) und (Abbildung 4). Jeder Arbeiter erhielt einen weiteren ähnlichen Satz Früchte (5 Mangos und 4 Papayas) zum Zerdrücken oder Sieben (ohne Fruchtschnitt), wobei 2 Stücke wie zuvor beschrieben befallen waren. Das Fruchtfleisch wurde in das obere Sieb gegossen und mit Wasser aus einem Wasserhahn durch den Siebestapel gewaschen und die Larven entfernt, wie im Protokoll beschrieben. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt, mit und ohne Zuckerflotation, um festzustellen, ob das Entfernen des Flotationsschritts die Geschwindigkeit des Prozesses erhöhen würde, ohne die Empfindlichkeit zu verlieren (d. h. alle oder die meisten Larven wurden gefunden) (Abbildung 3). Die Anzahl der gefundenen Larven und die Zeit, die jeder Arbeiter aufwendete, um die Früchte durch die Steck-, MSF- oder MS-Methode zu verarbeiten, wurden aufgezeichnet. Sowohl bei Mangos als auch bei Papayas führte die vollständige MSF-Methode (einschließlich Flotation) zu einer höheren Anzahl von Larvennachweisen und war schneller als das Schneiden von Früchten (Tabelle 1). Arbeiter, die die traditionelle Methode des Schneidens von Früchten anwandten, übersahen 32 % bzw. 35 % der Larven, die in Mangos bzw. Papaya platziert wurden (Tabelle 1). Die Verarbeitung von Früchten in loser Schüttung mit der MSF-Technik erforderte 30 % weniger Zeit als das Schneiden einzelner Mangos und 35 % weniger Zeit als das Schneiden einzelner Papayas (Abbildung 3). Mit der MSF-Methode wurden mehr Larven pro Minute für Papaya (Abbildung 3C) und Mango (Abbildung 3D) gefunden als mit der Fruchtschneidemethode. Alle gefundenen Larven lebten. Die morphologische Bestimmung der Larven ist nur für späte Stadien möglich. Wir wiederholten das obige Experiment, ließen aber die Flotationsprozedur weg, um festzustellen, ob die Erholung der Larven hoch blieb und die Geschwindigkeit der Fruchtverarbeitung zunahm. Die MS-Methode (ohne Flotation) führte zu mehr Larvennachweisen für Papaya (Abbildung 4A) und Mango (Abbildung 4B) im Vergleich zum Schneiden und zur visuellen Inspektion. Darüber hinaus war die Technik schneller als das Schneiden und visuelle Inspizieren von Papaya (Abbildung 4C) und Mango (Abbildung 4D). Durch die Streichung des Flotationsschritts aus der MSF-Methode konnte die Zeit bis zum Auffinden von Larven im späten Stadium bei Papaya um 90 % und bei Mangos um 48 % reduziert werden (Tabelle 2). Der Prozentsatz der gefundenen Larven war bei beiden Methoden hoch und bei MS durchweg höher (Floatation weggelassen). Bei der Papaya wurden 80 % bzw. 85 % der Larven mit der MSF- bzw. MS-Methode gewonnen (Tabelle 1 und Tabelle 2). Bei Mango wurden 88 % bzw. 95 % aus der MSF- bzw. MS-Methode gewonnen (Tabelle 1 und Tabelle 2). Feldvergleich der Obstschneide- und MSF-MethodeDas Ziel dieses Experiments war es, die Methoden des Obstschneidens und der MSF unter Feldbedingungen zu vergleichen, wobei ein Notfallprogramm für Fruchtfliegen nachgeahmt wurde. Die Verarbeitung der Früchte wurde ohne die Bequemlichkeit und Infrastruktur des Labors durchgeführt, um die Feldreife der beiden Larvenextraktionsmethoden zu testen. Die Arbeiten wurden in einer Guavenplantage durchgeführt, die sich im Keimplasma der USDA-ARS Tropical Plant Genetic Resources and Disease Research Unit in der Nähe von Hilo befindet. Insgesamt wurden 40 Guaven mit Anzeichen von Befall gesammelt und in 2 Gruppen eingeteilt. Insgesamt wurden 20 Guaven einer Schnitt-/Sichtprüfung unterzogen, gefolgt von MSF (einschließlich Flotation), wodurch die Sensitivität der Schneidemethode im Vergleich zur MSF-Methode bewertet werden konnte. Die Sektion verlief wie oben beschrieben. Wenn sie entdeckt wurden, wurden die Larven entnommen und gezählt. Vier Arbeiter sezierten jeweils 5 Guaven, und die Zeit, die für das Schneiden und Inspizieren benötigt wurde, wurde für jeden Arbeiter aufgezeichnet. Das Nachschneiden von MSF wurde wie oben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass zusätzlich zu den Sieben Nr. 8 und Nr. 20 ein drittes Sieb mit kleineren Maschen (Nr. 40, 0,420 mm) verwendet wurde, um kleinere Larven zu sammeln. Der zweite Satz von 20 Guaven wurde in 2 Zip-Lock-Beutel (10 Früchte pro Beutel) gegeben und nur MSF unterzogen (d.h. kein Schneiden), was einen Vergleich der Zeit ermöglichte, die für das Schneiden von Früchten benötigt wurde, im Vergleich zu MSF. Wie oben wurden bei diesem Verfahren drei Siebe verwendet. Die Anzahl der gefundenen Larven und die Gesamtzeit für die Verarbeitung der Früchte (Pürieren und Halten der Früchte für 5 min im Beutel/Sieben/Aufschwimmen in Zuckerlösung) wurden aufgezeichnet. Wie im Labor festgestellt wurde, unterschätzte der Obstschnitt den Obstbefall und war sehr variabel: Es wurden 25 % bis 83 % weniger Larven nachgewiesen, als mit MSF-Methoden gewonnen werden konnten (Tabelle 3). Darüber hinaus gewann Ärzte ohne Grenzen in der Probe mit geringer Anzahl von Larven 500 % mehr Larven, was eine höhere Assay-Sensitivität und eine größere Chance zur Identifizierung des befallenden Organismus bietet. Die Früchte wurden mit der MSF-Methode viel schneller verarbeitet als mit dem Schneiden; Das Schneiden und Untersuchen von 5 Früchten dauerte ungefähr so lange wie die Verarbeitung von 10 Früchten mit Ärzte ohne Grenzen. Abbildung 1: Schritte des Extraktionsprotokolls für Fruchtfliegenlarven . (A) Verarbeiten Sie ca. 2 Liter Frucht auf einmal (z. B. 5 Guaven oder 5 mittelgroße Mangos sind ausreichende Proben für diese Methode). (B) Schneiden Sie die Früchte in große Stücke und legen Sie sie in einen 4-Liter-Aufbewahrungsbeutel mit Reißverschluss. (C) Geben Sie Wasser in den Beutel, bis das Wasser die gehackten Früchte um 25-50 mm bedeckt. (D) Drücken Sie die Früchte vorsichtig von Hand aus, bis sich das gesamte Fruchtfleisch von der Schale gelöst hat und eine glatte Konsistenz hat (d. h. keine großen Stücke). (E) Stapeln Sie das Sieb mit dem großmaschigen Sieb (Nr. 8; 2,36 mm) darauf, gefolgt vom kleinen Sieb (Nr. 20; 0,85 mm). Für frühe Stadien ein drittes Sieb (Nr. 45; 0,35 mm) auf den Boden des Stapels legen. (F) Gießen Sie das Fruchtfleisch in das obere Sieb. (G) Waschen Sie das Fruchtfleisch gründlich durch den Siebstapel mit Wasser aus einem Wasserhahn, einem Schlauch oder einer Flasche, bis das feine Fruchtfleisch durch das erste Sieb gegangen ist. (H) Scannen Sie die oberen Siebe visuell nach Larven im späten Stadium, die möglicherweise mit der Schale oder großen Fruchtstücken zurückgehalten wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Extraktion von Anastrepha suspensa im frühen und späten Stadium aus Feldfrüchten. Die mittlere Anzahl (± Standardfehler des Mittelwerts [SE]) von Anastrepha suspensa-Larven von fünf Guavenfrüchten, die durch Schneiden und Sichtkontrolle (Schneiden: 70,4 ± 11,9) oder Waschen des Fruchtfleisches durch eine Reihe von drei Sieben und anschließendes Einweichen des Fruchtfleisches in einer Zuckerwasserlösung (MSF: 175,6 ± 21,91) gesammelt wurden (A). Die durchschnittliche Anzahl der Larven (±SE), die pro Minute von 5 Guaven gesammelt wurden, die durch Schneiden (1,21 ± 0,16) und durch MSF (3,71 ± 0,50) verarbeitet wurden (B). Jede Methode wurde 5 Mal wiederholt, und Sternchen über den Balken zeigen signifikante Unterschiede für die Anzahl der Larven (χ 2 = 6,81, p < 0,01) und die Verarbeitungszeit (χ2 = 6,80, p < 0,01) an, basierend auf einem Kruskal-Wallis-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Validierung der vollständigen Mushing-Sieving-Floatation-Methode unter Verwendung des manuellen Befalls von Mango und Papaya, um einen geringen Befall mit Bactrocera dorsalis zu simulieren. Die mittlere Anzahl der Bactrocera dorsalis Larven (±SE) in Papaya (Steckling: 3,25 ± 0,51, MSF: 4,0 ± 0,4) (A) und Mango (Steckling: 3,4 ± 0,51, MSF: 4,4 ± 0,4) (B) Früchten und die durchschnittliche Anzahl der Larven (±SE), die pro Minute von Papaya (Steckling: 0,21 ± 0,1, MSF: 0,4 ± 0,15) (C) und Mango (Schnitt: 0,14 ± 0,01, MSF: 0,21 ± 0,03) gesammelt wurden (D). Früchte, die mit dem Stecklings- oder dem MSF-Verfahren (inkl. Flotation, n = 5) von Hand mit 5 Larven im dritten Stadium befallen wurden. Sternchen über den Balken zeigen signifikante Unterschiede für die Anzahl der Larven bei Papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) und Mango (χ2 = 3,94, p = 0,05) im Vergleich zum Fruchtschnitt auf der Grundlage von Kruskal-Wallis-Tests an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Validierung der Mushing-Sieb-Methode (Flotation entfernt) unter Verwendung eines manuellen Befalls von Mango und Papaya, um einen geringen Befall mit Bactrocera dorsalis zu simulieren. Die mittlere Anzahl der Larven (±SE) in Papaya (Steckling: 1,25 ± 0,48, MS: 4,25 ± 0,48) (A) und Mango (Steckling: 2,5 ± 0,5, MS: 4,75 ± 0,25), (B) Früchte und die durchschnittliche Anzahl der pro Minute gesammelten Larven (±SE) in Papaya (Steckling: 0,15 ± 0,05, MS: 0,76 ± 0,15) (C) und Mango (Schnitt: 0,16 ± 0,04, MS: 0,44 ± 0,04) (D). Die Früchte wurden manuell mit 5 Larven des dritten Stadiums Bactrocera dorsalis befallen und durch Schneiden und Sichtkontrolle (Schneiden) verarbeitet oder in einem Beutel zerdrückt und durch Siebe gewaschen (nur Zerdrücken und Sieben, ohne Flotation, n = 4). Sternchen über den Balken zeigen signifikante Unterschiede für die Anzahl der Larven in Papaya (χ 2 = 5,46, p = 0,02) und Mango (χ 2 = 5,25, p = 0,02) und die Zeit für die Verarbeitung von Papaya (χ 2 = 5,39, p = 0,02) und Mango (χ 2 = 5,39, p = 0,02) im Vergleich zum Fruchtschnitt an, basierend auf Kruskal-Wallis-Tests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Obst # Verarbeitetes Obst #Larvae hinzugefügt Art der Verarbeitung #Larvae gefunden Bearbeitungszeit (min)* % Rückgewinnung Mango 25 25 Schneiden 17 158 68% Mango 25 25 MSF 22 113 88% Papaya 16 20 Schneiden 13 62 65% Papaya 16 20 MSF 16 40 80% *Die Gesamtzeit summiert sich auf 5 Mitarbeiter. Tabelle 1: Die Anzahl der geborgenen Larven und die Zeit für die Verarbeitung der Früchte durch das Schneiden und visuelle Inspektion (Schneiden) oder das vollständige Zerkleinern, Sieben und Schwimmen (MSF). Die Testfrucht wurde manuell mit 5 Larven im dritten Stadium befallen, die mit gebohrten und verdeckelten Früchten (1 der 5 Mangos, 1 der 4 Papayas) vermischt waren. Obst # Verarbeitetes Obst #Larvae hinzugefügt Art der Verarbeitung #Larvae gefunden Bearbeitungszeit (min)* % Rückgewinnung Mango 20 20 Schneiden 10 66 50% Mango 20 20 FRAU 19 44 95% Papaya 16 20 Schneiden 5 38 25% Papaya 16 20 FRAU 17 25 85% *Die Gesamtzeit summiert sich auf 4 Mitarbeiter. Tabelle 2: Die Anzahl der geborgenen Larven und die Zeit, um die Früchte nur durch Schneiden oder Zerdrücken und Sieben zu verarbeiten, ohne Flotation (MS). Die Testfrüchte wurden manuell mit fünf Larven im dritten Stadium befallen, die mit gebohrten und verdeckelten Früchten vermischt waren (1 von 5 Mangos, 1 von 4 Papayas). Arbeiter/Methode #Fruit verarbeitet Bearbeitungszeit (min) #Larvae fand Schnitt #Larvae fanden Ärzte ohne Grenzen* % der Gesamtzahl der Larven, die durch Schneiden gefunden wurden Arbeiter 1: Schneiden 5 18 33 14 70% Arbeiter 2: Schneiden 5 18 1 5 17% Arbeiter 3: Schneiden 5 26 9 11** 75% Arbeiter 4: Schneiden 5 20 24 Arbeiter 5: Ärzte ohne Grenzen 10 22 NA 22 NA Arbeiter 6: Ärzte ohne Grenzen 10 18 NA 37 NA * Der Zellstoff aus dem Zuschnitt und die visuelle Inspektion wurden erneut mit der MSF-Methode verarbeitet, um die Anzahl der übersehenen Larven im späten 2.und 3. Stadium zu bestimmen ** Fruchtfleisch der Arbeiter 2 und 3 Früchte, die vor der Verarbeitung mit der MSF-Methode gepoolt wurden Tabelle 3: Die Anzahl der Larven, die in vor Ort gesammelter Guave gefunden wurden, indem die Frucht geschnitten und visuell inspiziert (Steckling) oder die Früchte zerdrückt, gesiebt und geschwommen (MSF) wurden.

Discussion

Unser Ziel war es, eine effiziente und effektive Methode zu entwickeln, um Tephritidenlarven im Freiland zu finden. Die Motivation für den Start eines Ausrottungsprogramms oder die Einrichtung eines Quarantänegebiets ist der Nachweis von begatteten Weibchen oder Larven6, was auf eine Brutpopulation hinweist. Die derzeitige Methode zum Schneiden und visuellen Suchen von Früchten ist ineffizient, um Larven zu finden, da in der Regel viel mehr Wirtsfrüchte vorhanden sind, als einzeln inspiziert werden können. Darüber hinaus sind die Populationen der Tephritiden in einem Gebiet mit neuer Invasion wahrscheinlich gering, was die Chancen, Larven in einer großen Menge von Früchten zu finden, unglaublich schwierig macht. So wurden beispielsweise 2015 im Rahmen des Ausrottungsprogramms von Bactrocera dorsalis in Florida 54 verschiedene Wirtsarten identifiziert und mehr als 4.000 Früchte geschnitten. Bei diesem Ausrottungsprogramm wurden nur wenige Larven in Mango gefunden, und es wurden keine anderen Wirte gefunden, die befallen waren6. Wir fanden heraus, dass die MSF/MS-Methode sowohl empfindlicher als auch schneller beim Nachweis von A. suspensa – und B. dorsalis-Larven war, wenn Früchte verarbeitet wurden, die eine große Menge an Fruchtfleisch (Mangos, Guaven und Papaya) in großen Mengen enthielten, verglichen mit dem Schneiden von Früchten. Die größere Menge an Wirtsfrüchten, die mit der Mushing- und Siebmethode inspiziert werden kann, könnte in Kombination mit der erhöhten Erkennung einer seltenen Larve die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass ein Befall frühzeitig erkannt wird. Die frühzeitige Erkennung einer Brutpopulation könnte die Wahrscheinlichkeit einer Ausrottung erhöhen und die Kosten des Programms senken.

Unsere Experimente zeigten, dass die Anzahl der Larven, die von Arbeitern beim Schneiden und visuellen Inspizieren von Früchten entdeckt wurden, erheblich variierte. Beim Schneiden von Früchten fehlten 50 % bzw. 75 % der B. dorsalis-Larven , die in Mangos bzw. Papaya platziert wurden. Im Gegensatz dazu wurden nur 5 % bzw. 15 % der Larven mit der MS-Methode zur Verarbeitung von Mango- bzw. Papayafrüchten übersehen. In ähnlicher Weise ergab eine Studie, in der das Schneiden von Früchten an den Einreisehäfen bewertet wurde, dass die Anzahl der von den Inspektoren gefundenen befallenen Früchte und Larven erheblich schwankte8. Die Studie zeigte, dass erfahrene Hafeninspektoren 64 % bis 99 % der Larven von A. suspensa und 16 % bis 82 % der befallenen Früchte übersahen, wenn die Früchte geschnitten und visuell kontrolliert wurden8. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zerkleinerungs- und Siebmethode die Wahrscheinlichkeit verringern könnte, dass ein Arbeiter eine befallene Frucht übersieht.

Zucker- und Heißwasser-Flotation sind akzeptierte Protokolle in einem Systemansatz, um sicherzustellen, dass Kirschen und Heidelbeeren frei von Fruchtfliegen sind14. Eine Teilmenge einer Sendung wird in die Lösung zerkleinert, woraufhin ein Inspektor die Oberfläche der Zuckerlösung visuell auf das Vorhandensein von Eiern und Larven untersucht. Obwohl eine größere Anzahl von Früchten verarbeitet werden kann als das Schneiden einzelner Früchte, wird die Wahrscheinlichkeit, Larven mit diesen Techniken zu finden, immer noch von den Fähigkeiten des Inspektors, dem Stadium und der Anzahl der vorhandenen Larven und der Art der Frucht beeinflusst8. Wir fanden heraus, dass sich B. dorsalis und A. suspensa, wie andere Tephritiden auch, aus dem Fruchtfleisch lösen und an die Oberfläche schwimmen. Interessanterweise fanden wir heraus, dass bei größeren Larven im späten Stadium, die das Ziel von Notfall- und Ausrottungsprogrammen sind, da sie morphologisch identifiziert werden können, einschließlich der Zuckerflotation, die Genauigkeit der Methode nicht erhöht wurde. Tatsächlich verlängerte die Zugabe der Flotationsmethode die Verarbeitungszeit um 90 % für Papaya und um 48 % für Mango. Die verlängerte Verarbeitungszeit und die zusätzlichen Materialien (z. B. Wasser, Behälter, Zucker usw.) unterstützen das Hinzufügen dieses Schritts bei der Suche nach großen Stadien im Feld nicht. Die Zucker-Floating-Methode kann geeignet sein, wenn das Ziel darin besteht, alle Stadien einschließlich der frühen Stadien zu erkennen, wie z. B. an Eingangshäfen und Packhäusern. Die Filtration der Zuckerlösung mit einem feinmaschigen Sieb würde höchstwahrscheinlich den genauesten Nachweis von Eiern und frühen Larvenstadien ermöglichen11,12.

Die MS- und MSF-Techniken eignen sich gut für Früchte, die leicht zerkleinert werden können und ein großes Fruchtfleischvolumen aufweisen. Tephritidenlarven neigen dazu, sich in das Fruchtfleisch einzugraben, was die visuelle Erkennung erschwert. Ein kritischer Aspekt der MS- und MSF-Methoden ist die Trennung der Larven von der Pulpa. Durch den Siebvorgang wird das Fruchtfleisch entfernt, wodurch die Larven auf Siebsieben freigelegt werden. In ähnlicher Weise trennt die Zuckerwassermethode die Larven vom Fruchtfleisch, indem sie die Larven schwimmen lässt, während das Fruchtfleisch auf den Boden der Pfanne sinkt. Larven, die mit der MS- oder MSF-Methode vom Fruchtfleisch getrennt werden, können leicht beobachtet werden, wie sie sich auf dem Sieb oder der Wasseroberfläche bewegen. Obwohl die Methode des Zerkleinerns, Siebens und optional des Schwimmens die Geschwindigkeit und Genauigkeit des Nachweises von Tephritidenlarven in wichtigen Wirtsfrüchten erheblich verbessert hat, ist das Verfahren möglicherweise nicht für alle Früchte geeignet. Zum Beispiel können Wirtsfrüchte mit hartem Fruchtfleisch, wie z. B. grüne Avocados, oder Früchte mit einem großen Samen/Kern und einer relativ geringen Menge an Fruchtfleisch, wie tropische Mandeln, durch manuelles Schneiden und visuelle Inspektion einfacher zu verarbeiten sein.

Wir fanden heraus, dass die MS- und MSF-Methoden schneller waren, wenn eine relativ kleine Anzahl von Früchten (5-10) verarbeitet wurde. Der Unterschied wäre wahrscheinlich größer, wenn größere Mengen an Früchten verarbeitet würden, was notwendig und typisch für Notfall-Fruchtfliegenprogramme sein könnte. Durch das Entfernen des Flotationsschritts wurde die Detektionsgeschwindigkeit weiter erhöht, ohne die Genauigkeit beim Auffinden großer Tephritidenlarven (>3 mm) zu beeinträchtigen. Wir zeigten, dass diese Techniken auf das Feld übertragen werden können, indem wir die Bedingungen simulierten, denen Arbeiter während eines Notfallprogramms für Fruchtfliegen ausgesetzt waren. Unsere Studien deuten darauf hin, dass die MS-Methoden einen rechtzeitigeren Nachweis von Larven im späten Stadium und die anschließende Ausrottung von Tephritiden-Brutpopulationen ermöglichen könnten. Ärzte ohne Grenzen könnte zur Erkennung von Eiern und frühen Stadien eingesetzt werden, die derzeit nicht von Ausrottungsprogrammen betroffen sind.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegría und Alejandra Canon für die Unterstützung bei der Verarbeitung der Guave an der University of Florida, Rick Kurashima, Jean Auth und Bruce Inafuku für die Hilfe bei der Bewertung der künstlich befallenen Frucht auf Hawaii und Michael Stulberg für hilfreiche Kommentare zu früheren Versionen des Manuskripts. Dieses Projekt wurde teilweise von USDA APHIS und University of Florida Cooperative Agreement finanziert und teilweise von USDA-ARS unterstützt (Projekt 2040-22430-027-00D). Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in dieser vorläufigen Veröffentlichung wurden nicht offiziell vom USDA verbreitet und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie eine Feststellung oder Politik der Behörde darstellen. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich dem Zweck der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das USDA. Das USDA ist ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber.

Materials

Anti foamer MicroLubrol ML200-50-4 MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com
Brown Sugar Dominos 1 lb Box  Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar
Cutting Boards KitchenAid KE703NOSMGA KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12×18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11×14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0
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EthOH Fisher Scientific BP8202500 Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Glass Vials Fisher Scientific 0333921H Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H
Knives Zyliss 31380 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords=
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Zipper Lock Storage Bags Ziploc 682254 Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords=
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Roda, A. L., Steck, G., Fezza, T., Shelly, T., Duncan, R., Manoukis, N., Carvalho, L., Fox, A., Kendra, P., Carrillo, D. Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field. J. Vis. Exp. (197), e65501, doi:10.3791/65501 (2023).
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