筛分果肉以检测田间未成熟的破蝇果蝇

早龄和 晚龄 从 田间采集的果实中提取在这个实验中，我们比较了水果切割和捣碎，筛分和漂浮（MSF）方法在检测到幼虫的比例和检测它们所需的平均时间方面。番石榴受到 Anastrepha suspensa幼虫的高度感染，是从位于佛罗里达州霍姆斯特德的佛罗里达大学食品和农业科学研究所，热带研究和教育中心的植物中收集的。将果实随机分为5组，并分配到2种幼虫提取方法中的1种：1）手工切割或2）MSF方法。记录使用每种提取方法收集所有肉眼可见的幼虫的时间。 手工切割方法遵循了根除计划目前使用的方法。5名工人（n = 5）中的每一个被分配5个水果，通过将水果切成小块并目视检查果肉来搜索幼虫的所有阶段。为了确定目视检查中是否遗漏了幼虫，使用解剖显微镜（10x）重新检查手工切割的果块。 对于MSF方法，将5个水果切成大块（50-80厘米），放入拉链袋中，用手轻轻挤压，直到所有果肉从果皮中脱落并且果有光滑的稠度（即没有大块）。糊状水果通过一系列大（45.7厘米）黄铜筛过滤。最大的网眼（8号）堆放在顶部，其次是20号和45号筛。负责此处理的工作人员使用连接到水槽水龙头的软管中的水通过网状清洗纸浆。晚龄幼虫在筛子中很明显。较小的幼龄与果肉混合，使其难以看到和去除。因此，将筛子中的纸浆/幼虫混合物放入装有1L红糖水溶液的桶中。幼虫立即浮出水面。轻轻搅拌溶液，5分钟后，从桶中取出幼虫并计数。处理水果的时间是糊化，筛分和从糖水溶液中去除幼虫的组合。使用Kruskal-Wallis非参数检验（p = 0.05）16分析通过手工切割或筛分和漂浮方法发现的幼虫数量数据。 与手工切割相比，MSF方法产生更多的幼虫（图2A）和每分钟更多的幼虫（图2B）。虽然在这项研究中没有量化对不同龄的检测，但我们观察到所有龄（第一、第二和第三）都是用筛子发现的，而只有后来的龄人（第二和第三）是用手切发现的。当用解剖显微镜镜重新检查先前切割和目视检查的样品时，40%的晚龄幼虫感染了果实。然而，早期的幼崽主要是在重新检查时发现的。 本实验表明，使用MSF方法在高度受感染的水果中寻找幼虫更有效和高效。然而，在根除计划中更有可能遇到幼虫数量较少的水果，其中入侵物种非常罕见。因此，我们进行了一项实验室研究，其中宿主果实被已知数量的少量幼虫感染。 手动侵扰芒果和木瓜以模拟背 侧芽孢杆菌 侵扰该实验比较了水果切割和无国界医生方法在检测到幼虫的比例以及感染相对较低时检测它们所需的时间。人工感染被用作评估每种方法功效的实验工具，因为存在的幼虫数量是确定的。 使用软木螟（直径1.0厘米）在单个芒果和木瓜果实上打5个孔，这些果实没有果蝇幼虫。将单个晚二至初三龄背 芽孢杆菌 幼虫放入果实子子集的5个孔中的每一个孔中。使用从果实上钻出的碎片盖住孔，其余果实在不插入幼虫的情况下盖上，以直观地模拟人工侵扰。将果实在27°C下保持48小时，以允许幼虫发育。该实验在夏威夷岛希洛的ARS实验室（n = 5名工人）和夏威夷瓦胡岛的APHIS-PPQ实验室（n = 4名工人）进行。 为了切果，每个工人被给予5个芒果（1个被1个幼虫感染，4个没有被感染）和4个木瓜（一个被感染，3个没有被感染）。一名工人将每个水果单独切成越来越小的块，并不断检查果肉是否有任何未成熟的果蝇。当对纸浆进行彻底检查后，搜索停止了。记录发现的幼虫总数以及每个工人通过切割处理所有果实所花费的时间（图3）和（图4）。 每个工人都收到了另一组类似的水果（5个芒果和4个木瓜）用于糊状或筛分（不涉及水果切割），如前所述，有2块被感染。将纸浆倒入顶筛中，并使用水龙头中的水冲洗筛子堆并去除幼虫，如协议中所述。该实验进行了两次，有糖漂浮和没有糖漂浮，以确定去除漂浮步骤是否会在不失去灵敏度的情况下提高过程的速度（即，发现所有或大多数幼虫）（图3）。记录发现的幼虫数量以及每个工人通过切割，MSF或MS方法处理果实所花费的时间。 对于芒果和木瓜，全MSF方法（包括漂浮）导致更多的幼虫检测，并且比水果切割更快（表1）。使用传统水果切割方法的工人分别错过了芒果和木瓜中的32%和35%的幼虫（表1）。使用MSF技术加工散装水果所需的时间比切割单个芒果的时间少30%，比切割单个木瓜的时间少35%（图3）。与水果切割方法相比，使用MSF方法对木瓜（图3C）和芒果（图3D）每分钟发现更多的幼虫。所有发现的幼虫都是活的。 幼虫形态学鉴定仅适用于晚龄。我们重复上述实验，但省略了漂浮程序，以确定幼虫的恢复率是否保持高水平，果实加工速度是否提高。与切割和目视检查相比，MS方法（省略浮选）导致木瓜（图4A）和芒果（图4B）的幼虫检测更多。此外，该技术比切割和目视检查木瓜（图4C）和芒果（图4D）更快。从MSF方法中去除漂浮步骤可将木瓜发现晚龄幼虫的时间缩短了90%，芒果减少了48%（表2）。两种方法的幼虫百分比都很高，MS的发现幼虫百分比始终较高（省略漂浮）。对于木瓜，分别从MSF和MS方法中回收了80%和85%的幼虫（表1 和 表2）。对于芒果，MSF和MS方法分别回收了88%和95%（表1 和 表2）。 水果切割和MSF方法的现场比较该实验的目的是比较田间条件下的水果切割和MSF方法，模仿紧急果蝇计划。水果加工是在没有实验室的便利和基础设施的情况下进行的，以测试两种幼虫提取方法的田间准备情况。工作是在位于希洛附近的USDA-ARS热带植物遗传资源和疾病研究单位种质的番石榴园进行的。共收集了40只有侵扰迹象的番石榴，并分为2组。总共对20个番石榴进行了切割/目视检查，然后进行了MSF（包括漂浮），从而可以评估切割方法与MSF方法相比的灵敏度。解剖按上述方式进行。检测到后，取出幼虫并计数。四名工人每人解剖5个番石榴，并记录了每个工人切割和检查所需的时间。切割后MSF如上所述进行，除了8号和20号筛外，还使用了第三个较小的筛子（40号，0.420毫米）来收集较小的幼虫。第二组20个番石榴被放置在2个拉链袋（每袋10个水果）中，并且仅进行MSF（即不切割），这样可以比较水果切割与MSF所需的时间。如上所述，在此过程中使用了三个筛子。记录发现的幼虫数量和处理水果的总时间（将水果糊化并保持在袋中5分钟/筛分/漂浮在糖溶液中）。 正如在实验室中发现的那样，水果切割低估了水果侵扰，并且变化很大，检测到的幼虫比使用MSF方法可以回收的幼虫少25%-83%（表3）。此外，在幼虫数量较少的样本中，无国界医生回收的幼虫增加了500%，提供了更高的测定灵敏度和更大的机会来识别感染生物。与切割相比，使用MSF方法加工水果的速度要快得多;切割和检查 5 个水果所需的时间与通过 MSF 加工 10 个水果所需的时间大致相同。 图1：果蝇幼虫提取方案的步骤。 （A）一次处理约2升体积的水果（例如，5个番石榴或5个中等大小的芒果构成该方法的足够样品）。（B）将水果切成大块，放入4升拉链锁储物袋中。（C）向袋子中加水，直到水覆盖切碎的水果25-50毫米。 （D）用手轻轻挤压水果，直到所有果肉从果皮上脱落并具有光滑的稠度（即没有大块）。（E）将筛子与大网（8号;2.36毫米）筛子堆叠在上面，然后是小网（20号;0.85毫米）筛子。对于早期的龄人，在堆栈的底部放置第三个筛子（No. 45; 0.35 mm）。（F）将纸浆倒入顶筛中。（G）用水龙头，软管或瓶子中的水通过筛子堆彻底清洗纸浆，直到细纸浆通过第一个筛子。（H）目视扫描顶部筛子，寻找可能与果皮或任何大块水果一起保留的晚龄幼虫。 请点击此处查看此图的大图。 图2：从田间采集的果实中提取早龄和晚龄的Anastrepha sususpensa。通过切割和目视检查（切割：70.4 ± 11.9）或通过一系列三个筛子清洗果肉，然后将果肉浸泡在糖水溶液中（MSF：175.6 ± 21.91）（A）从五种番石榴果实中收集的Anastrepha sususpensa幼虫的平均数（±标准误差）。通过切割（1.21±0.16）和MSF（3.71±0.50）处理的5个番石榴每分钟收集的平均幼虫数（±SE）（B）。每种方法重复5次，条形上方的星号表示基于Kruskal-Wallis检验的幼虫数量（χ 2 = 6.81，p < 0.01）和处理时间（χ2 = 6.80，p < 0.01 ）的显着差异。 请点击此处查看此图的大图。 图 3：使用手动侵扰芒果和木瓜来模拟低背芽孢杆菌侵扰的全糊化-筛分-漂浮方法的验证。在木瓜（切割：3.25±0.51，MSF：4.0±0.4）（A）和芒果（切割：3.4±0.51，MSF：4.4±0.4）中发现的果实和平均数量的背侧芽孢杆菌幼虫（±±SE）（切割：0.21±0.1，MSF：0.4±0.15）（C）和芒果（切割：0.14±0.01，MSF：0.21±0.03）（D).使用切割或MSF方法（包括漂浮，n = 5）手工感染5个第三龄幼虫的水果。条形上方的星号表示与基于Kruskal-Wallis测试的水果切割相比，木瓜（χ2 = 5.39，p = 0.02）和芒果（χ2 = 3.94，p = 0.05）中发现的幼虫数量存在显着差异。 请点击此处查看此图的大图。 图 4：使用芒果和木瓜的手动侵扰来模拟低背蝽侵扰的糊化-筛分方法（去除浮选）的验证。 木瓜（扦插：1.25±0.48，质谱：4.25±0.48）（A）和芒果（扦插：2.5±0.5，质谱：4.75±0.25）（B）果实的平均幼虫数（±±SE）和木瓜（扦插：0.15±0.05，质谱：0.76±0.15）（C）和芒果（扦插：0.16±0.04，质谱：0.44±0.04）（D）。用5个三龄背蝇幼虫人工侵染果实，通过切割和目视检查（切割）或糊装在袋子中并通过筛子清洗（仅糊状和筛分，不漂浮，n = 4）。条形上方的星号表示在木瓜（χ 2 = 5.46，p = 0.02）和芒果（χ2 = 5.25，p = 0.02）中发现的幼虫数量以及加工木瓜（χ 2 = 5.39，p = 0.02）和芒果（χ 2 = 5.39，p = 0.02）与果实切割相比的显着差异，基于Kruskal-Wallis测试。 请点击此处查看此图的大图。 水果 # 水果加工 #Larvae 已添加 加工方法 找到 #Larvae 处理时间（分钟）* 回收率百分比 芒果 25 25 切削 17 158 68% 芒果 25 25 无国界医生 22 113 88% 木瓜 16 20 切削 13 62 65% 木瓜 16 20 无国界医生 16 40 80% *总时间加起来超过5名工人。 表1：通过切割和目视检查（切割）或全糊化，筛分和漂浮（MSF）方法回收的幼虫数量和加工果实的时间。 测试果实被5个三龄幼虫与无聊和加盖的水果混合（5个芒果中的1个，4个木瓜中的1个）手动感染。 水果 # 水果加工 #Larvae 已添加 加工方法 找到 #Larvae 处理时间（分钟）* 回收率百分比 芒果 20 20 切削 10 66 50% 芒果 20 20 女士 19 44 95% 木瓜 16 20 切削 5 38 25% 木瓜 16 20 女士 17 25 85% *总时间加于 4 名工人。 表2：回收的幼虫数量和仅通过切割或糊化和筛分处理果实的时间，省略漂浮（MS）。 测试果实被五种三龄幼虫与无聊和加盖的果实混合（五分之一的芒果，四分之一的木瓜）手动感染。 工作器/方法 已处理 #Fruit 处理时间（分钟） #Larvae 发现切割 #Larvae 找到无国界医生* 通过切割发现的幼虫总数的百分比 工人1：切割 5 18 33 14 70% 工人2：切割 5 18 1 5 17% 工人3：切割 5 26 9 11** 75% 工人4：切割 5 20 24 工作人员 5：无国界医生 10 22 那 22 那 工人 6：无国界医生 10 18 那 37 那 * 纸浆从切割和目视检查再次处理使用MSF方法确定晚2-3龄幼虫漏诊的数量 ** 在使用MSF方法加工之前，工人2和3水果的果肉汇集在一起 表3：通过切割和目视检查果实（切割）或通过捣碎，筛分和漂浮（MSF）水果在田间收集的番石榴中发现的幼虫数量。