In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

NOTA: Tutte le tecniche di coltura cellulare devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare e le cellule devono essere incubate a 37 °C in atmosfera umificata con il 5% di CO2 . Le istruzioni per tutti i preparati di citochine sia per il mantenimento (rhbFGF) che per il protocollo di differenziazione (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) sono riportate nella Tabella supplementare S1. 1. Coltura di hiPSC – scongelamento, mantenimento e congelamento delle cellule Preparazione del terreno di mantenimento, dei fattori di crescita e di altri reagentiPreparare il terreno di coltura aggiungendo l’intero substrato privo di siero, 36 mL di albumina sierica bovina (BSA) al 25% e 1 mL di 55 mM di β-mercaptoetanolo al terreno basale Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) di Dulbecco (vedere la tabella dei materiali). Risospendere 1 mg di inibitore della Rho chinasi (iRock) in 1 mL di DMSO, effettuare aliquote di 50 μL e conservarle a -20 °C.NOTA: Queste aliquote possono essere mantenute a -20 °C per 1 anno. Una volta scongelati, possono essere conservati a 4 °C per 1 settimana. Scongelare la soluzione di vitronectina (VTN-N) su ghiaccio e aliquotare 60 μL per flaconcino prima di conservarla a -80 °C. Poco prima di rivestire le piastre, diluire la scorta di 60 μL in 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS); concentrazione finale di 5 μg/mL. Scongelamento di linee cellulari hiPSCNOTA: La linea di cellule staminali pluripotenti umane SFCi55 è stata precedentemente derivata internamente e ampiamente utilizzata per la differenziazione in vari tipi di cellule e diverse linee embrionali 19,20,21,22.Rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di soluzione VTN-N per 1 ora a 37 °C.NOTA: Dopo l’incubazione, le piastre rivestite possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 1 settimana. Aspirare la soluzione VTN-N con una pipetta di aspirazione e aggiungere 1 mL di terreno di coltura preriscaldato integrato con 20 ng/mL di rhbFGF (Tabella supplementare S1). Scongelare rapidamente il flaconcino contenente le hiPSC a bagnomaria e trasferire la cellula in 5 mL di terreno di coltura preriscaldato. Centrifugare le celle per 3 minuti a 300 × g a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di terreno di coltura integrato con 20 ng/mL di rhbFGF. Trasferire le cellule in un pozzetto rivestito contenente già 1 mL di terreno. Aggiungere 5 μL di iRock nei pozzetti contenenti le cellule per un totale di 1,5 mL di terreno. Coltiva le cellule nell’incubatrice, cambia il terreno ogni giorno durante la settimana e alimenta due volte le cellule, aggiungendo il doppio del normale volume di terreno alle cellule per garantire l’alimentazione durante il fine settimana.NOTA: Le cellule vengono coltivate in presenza di iRock solo per 24 ore. Mantenimento e passaggio di hiPSCsSostituire il terreno ogni giorno con terreno di coltura fresco preriscaldato integrato con 20 ng/mL di rhbFGF. Far passare le cellule quando raggiungono circa l’80% di confluenza, generalmente due volte a settimana.Per far passare le celle, rivestire una piastra con VTN-N come descritto in precedenza nei passaggi 1.2.1 e 1.2.2. Aspirare il terreno dai pozzetti con le celle e lavarli con DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione (vedere la tabella dei materiali) e incubare per 1 min. Aspirare il reagente di dissociazione e incubare per altri 3 minuti. Picchiettare con decisione la piastra 10 volte su ciascun lato.NOTA: La fase di dissociazione potrebbe richiedere un’ottimizzazione specifica per tipo di cellula nel tempo di incubazione e nella procedura di spillatura. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura alle cellule e, con una pipetta Pasteur, lavare una volta con il terreno per assicurarsi che la maggior parte delle colonie venga raccolta. Aggiungere 150 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto per fornire un rapporto di passaggio di 1 pozzetto in 6.NOTA: Subito dopo lo scongelamento di un nuovo flaconcino, è meglio far passare le cellule con un rapporto inferiore come 1:1 o 1:2 per uno o due passaggi per consentire loro di raggiungere una fase di crescita costante prima di passare in un rapporto di 1:6. Coltiva le cellule nell’incubatrice, cambia il terreno ogni giorno durante la settimana e alimenta due volte le cellule una volta durante il fine settimana. Congelamento della linea cellulare delle hiPSCsNOTA: Congelare le cellule nei primi due passaggi dopo lo scongelamento per garantire il mantenimento di un lotto di fiale congelate a basso passaggio costante per avviare la coltura. Congelare le cellule quando raggiungono una confluenza di circa l’80%.Sostituire il terreno con terreno di coltura fresco preriscaldato integrato con 20 ng/mL di rhbFGF e 5 μL di iRock e incubare per almeno 1 ora. Staccare le celle come descritto nei passaggi 1.3.2.2-1.3.2.5. Raccogliere le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di terreno di coltura. Centrifugare per 3 minuti a 300 × g a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e aggiungere 1 mL di soluzione di crioconservazione (vedere Tabella dei materiali). Utilizzando una pipetta Pasteur, pipettare delicatamente le cellule su e giù per mescolarle nella soluzione di crioconservazione.NOTA: Evitare un pipettaggio eccessivo, che potrebbe causare la dissociazione dei gruppi di cellule. Dividere la sospensione cellulare in due fiale di crioconservazione da 0,5 mL ciascuna. Trasferire i flaconcini di crioconservazione in un contenitore di crioconservazione preraffreddato a 4 °C. Trasferire il contenitore con le cellule in un congelatore a -80 °C per 24 ore prima di trasferire i flaconcini in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. 2. Differenziamento delle hiPSCs in cellule endoteliali Preparazione del terreno di differenziazione, delle citochine e dei fattori di crescitaPreparare il terreno di differenziazione privo di siero (SFD) secondo la Tabella 1. Utilizzare questo mezzo dal giorno 0 al giorno 5 di differenziazione. Preparare un terreno privo di siero per le cellule CD34+ (SFM-34) aggiungendo 34 integratori alimentari e 5 mL di integratore di L-glutammina al terreno basale 34 SFM (vedere la tabella dei materiali). Usa questo mezzo dal giorno 6 di differenziazione in poi. Risospendere 1 mg di CHIR99021 in 716 μL di DMSO per ottenere una soluzione di 3 mM. Incubare a temperatura ambiente fino a completa risospendimento; se necessario, riscaldare rapidamente a 37 °C. Effettuare aliquote da 20 μL e conservarle a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Utilizzare immediatamente dopo lo scongelamento e non congelare o conservare. Risospendere le citochine secondo le istruzioni riportate nella Tabella supplementare S1. Conservare tutte le aliquote delle citochine a -80 °C. Differenziamento delle cellule endotelialiNOTA: Per ogni giorno di differenziazione, preparare 18 mL (3 mL di terreno/pozzetto) di terreno SFD preriscaldato, secondo le miscele di citochine descritte in Tabella 2.Giorno 0 – formazione dei corpi embrioidi (EBs)Preparare 18 mL di terreno SFD con la citochina Mix 1 secondo la Tabella 2, per ogni piastra a 6 pozzetti (3 mL/pozzetto). Aggiungere 2 mL di terreno SFD preriscaldato con Miscelare 1 citochina in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti repellente per cellule (vedere Tabella dei materiali). Per formare EB, seguire i passaggi descritti nei passaggi 1.3.2.2-1.3.2.4.NOTA: Assicurarsi che le hiPSC siano confluenti al 70-80% per avviare la differenziazione. Aggiungere 1 mL di terreno SFD preriscaldato con citochine Mix 1 a ciascun pozzetto di cluster di cellule distaccate. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire delicatamente i cluster cellulari in un singolo pozzetto di repellente cellulare per la formazione di EB in un rapporto di 1:1. Dopo aver posizionato la piastra nell’incubatrice, muoverla avanti e indietro, a destra e a sinistra, per disperdere uniformemente gli EB nel pozzetto. Giorno 1 – cambio medio agli EBNOTA: Questo passaggio è necessario solo se, entro il giorno 1 di differenziamento, ci sono molte cellule singole in sospensione accanto agli EB.Preparare 18 mL di terreno SFD con la citochina Mix 1 secondo la Tabella 2, per ogni piastra a 6 pozzetti (3 mL/pozzetto). Agitare la piastra con gli EB per spostarli al centro e raccoglierli utilizzando una pipetta Pasteur in una provetta da centrifuga da 15 mL.NOTA: Se gli EB appaiono raggruppati come in stringhe, separarli pipettandoli su e giù con un P1000 prima di raccoglierli nella provetta da centrifuga da 15 mL. Attendere 5-10 minuti affinché gli EB si depositino sul fondo del tubo.NOTA: Se gli EB sono troppo piccoli, centrifugarli per 5 minuti a 100 × g per aiutarli a stabilizzarsi. Lavare le piastre repellenti per cellule con acqua sterile o DPBS per rimuovere eventuali singole cellule o detriti. Aspirare con cautela e lentamente il surnatante dagli EB senza spostarli. Aggiungere 2 mL di SFD con citochine Mix 1 a ciascun pozzetto delle piastre repellenti per cellule. Risospendere gli EB utilizzando 1 mL di terreno SFD con citochine Mix 1 per ogni pozzetto di partenza – per una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 6 mL di terreno. Trasferire gli EB sulle piastre repellenti per cellule in un volume di 1 mL per pozzetto, che contiene già 2 mL di terreno SFD. Dopo aver posizionato la piastra nell’incubatrice, muoverla avanti e indietro, a destra e a sinistra, per disperdere uniformemente gli EB nel pozzetto. Giorno 2 – aggiunta di CHIR99021Far roteare gli EB al centro della piastra e aggiungere CHIR99021 secondo la Tabella 2 sul lato del pozzetto per evitare il contatto diretto con le cellule.NOTA: Se il mezzo non è stato cambiato al giorno 1, sostituire l’intero mezzo invece di aggiungere solo CHIR. Preparare 18 mL di terreno SFD con Mix 2 secondo la Tabella 2, per ogni piastra a 6 pozzetti (3 mL/pozzetto). Dopo aver posizionato la piastra nell’incubatrice, muoverla avanti e indietro, a destra e a sinistra, per disperdere uniformemente gli EB nel pozzetto. Giorno 3 – cambiamento medio degli EB e aggiunta di citochine Mix 3Preparare 18 mL di terreno SFD con Mix 3 citochine secondo la Tabella 2, per ogni piastra a 6 pozzetti (3 mL/pozzetto). Raccogliere gli EB come descritto nei passaggi 2.2.2.2-2.2.2.4. Aggiungere 2 mL preriscaldati di terreno SFD con le citochine Mix 3 alle piastre repellenti per le cellule. Aspirare con cautela il surnatante dagli EB. Aggiungere 1 mL/pozzetto di SFD con Mix 3 citochine. Distribuire gli EB tra i pozzetti come descritto nei passaggi 2.2.2.8-2.2.2.9. Giorno 6 – cambiamento medio per SFM-34 e aggiunta di citochine Mix 4Preparare 18 mL di terreno SFD con Mix 4 citochine secondo la Tabella 2, per ogni piastra a 6 pozzetti (3 mL/pozzetto). Raccogliere gli EB come descritto nei passaggi 2.2.2.2-2.2.2.4. Aggiungere 2 mL di terreno SFM-34 preriscaldato con le citochine Mix 4 alle piastre repellenti per le cellule. Aspirare con cautela il surnatante dagli EB. Aggiungere 1 mL/pozzetto di SFM-34 con Mix 4 citochine. Distribuire gli EB tra i pozzetti come descritto nei passaggi 2.2.2.8-2.2.2.9. 3. Isolamento e semina delle cellule CD34+ nel chip NOTA: Le cellule CD34+ vengono isolate tramite un approccio di isolamento positivo con un kit di microsfere CD34 (vedere Tabella dei materiali), che contiene microsfere CD34 coniugate ad anticorpi monoclonali di topo anticorpi anti-CD34 umani e reagente bloccante FcR (IgG umane). È importante convalidare l’efficienza dell’isolamento della colonna colorando le cellule prima e dopo l’isolamento per l’analisi della citometria a flusso, di seguito è indicato quando le cellule devono essere prelevate per questa analisi. Preparare materiali e reagenti.Preparare il tampone di lavaggio aggiungendo 5 mL di soluzione BSA al 5% e 200 μL di EDTA 0,5 M a 45 mL di DPBS per ottenere PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Preparare fresco per ogni isolamento, sterilizzare con filtro e conservare in frigorifero fino all’uso. Rivestire i trucioli fluidici con una soluzione di laminina preparata diluendo la rhLaminin 521 1:50 in DPBS Ca 2+ Mg2+. Rivestire ogni truciolo con il volume appropriato per il truciolo in uso e incubare nell’incubatrice per 2 ore prima della semina.NOTA: Altre matrici possono essere impiegate per il rivestimento e devono essere testate per il tipo di cella/esperimento specifico. Preparare il terreno Mix 4 SFM-34 integrando 18 mL di terreno SFM-34 con le citochine Mix 4 secondo la Tabella 2 e posizionare la miscela in una provetta da 50 mL nell’incubatrice con il coperchio leggermente svitato per facilitare lo scambio gassoso. Posizionare i set di perfusione selezionati e qualsiasi altro tubo da utilizzare nell’incubatore per degassare. Giorno 8 – dissociazione degli EB e isolamento CD34+Raccogliere gli EB come descritto nei passaggi 2.2.2.2-2.2.2.5. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare per ogni pozzetto iniziale di EB raccolti (se sono stati raccolti 6 pozzetti, aggiungere 6 mL). Trasferire 1 mL della sospensione EB nel reagente di dissociazione cellulare in ciascun pozzetto della piastra repellente per cellule. Incubare per 10 minuti nell’incubatrice. Pipettare delicatamente gli EB su e giù contro il pozzetto con un P1000, non più di 10 volte. Ripetere i passaggi 3.2.4-3.2.5.per un totale di 3 volte.NOTA: Se gli EB sono difficili da dissociare, ripetere i passaggi precedenti 4 volte in totale. Aggiungere 5 mL di tampone di lavaggio per ogni pozzetto di EB dissociati. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 mL facendole passare attraverso un colino da 40 μm. Prelevare 10 μL della sospensione cellulare per contare le cellule.NOTA: Per verificare l’efficienza dell’isolamento, trasferire 105 cellule/provetta in due provette diverse (controllo non colorato e campione preselezionato) che verranno utilizzate successivamente per la citometria a flusso (come descritto nei passaggi 4.3.9-4.3.13). Per una piastra a 6 pozzetti, ~106 cellule devono essere raccolte dopo la filtrazione. Centrifugare le celle per 10 minuti a 300 × g. Risospendere le cellule in 300 μL di tampone di lavaggio, pipettando delicatamente alcune volte per assicurarsi che non siano presenti grumi. Continuare a seguire il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali). Semina di cellule CD34+ in chip fluidiciNOTA: Il chip fluidico utilizzato nel protocollo ha un’altezza del canale di 0,6 mm e una lunghezza di 50 mm, per un’area di crescita totale di 2,5 cm2 (Figura supplementare S1). Questo tipo di chip viene seminato con un volume totale di sospensione cellulare di 150 μL. È possibile utilizzare diversi chip e il volume di semina e la densità cellulare devono essere adattati in base all’area di crescita. Potrebbe essere necessaria un’ulteriore ottimizzazione a seconda della linea cellulare utilizzata e della sua crescita.Risospendere le cellule CD34+ isolate in 300 μL di terreno SFM-34 preriscaldato con citochine Mix 4. Prelevare 10 μL di sospensione cellulare e contare le cellule. Risospendere 2,5 × 105 cellule in un volume finale di 150 μL integrato SFM-34; aggiungere 0,5 μL di iRock.NOTA: Per verificare l’efficienza dell’isolamento, trasferire 105 cellule/provetta in una provetta (campione post-selezionato) che verrà utilizzata successivamente per la citometria a flusso (come descritto nei passaggi 4.3.9-4.3.13). Aspirare lentamente la laminina dai trucioli fluidici inserendo la punta di un P200 all’interno del serbatoio sul bordo del canale.NOTA: Se il liquido è difficile da raccogliere, sollevare lentamente un lato del truciolo per aiutare il liquido a spostarsi verso il serbatoio opposto. Aggiungere costantemente la sospensione cellulare nel canale per assicurarsi che non si formino bolle.NOTA: Eseguire i passaggi 3.3.4-3.3.5 rapidamente ma delicatamente per evitare che la laminina si secchi e si formino bolle nei canali del truciolo. Se si formano delle bolle, sollevare un lato del chip e picchiettare delicatamente il vetrino per mobilitare le bolle; Quando raggiungono il serbatoio, saliranno verso l’interfaccia dell’aria e non dovrebbero essere in grado di entrare nel canale. Trasferisci il chip nell’incubatrice e lascialo per una notte in modo che le cellule siano completamente attaccate al canale e appaiano allungate. Quando le cellule sono completamente attaccate, aspirare il terreno come al punto 3.3.4 e sostituirlo con 200 μL di SFM-34 integrato con citochine. D’ora in poi, sostituire il terreno ogni giorno fino a quando le cellule non avranno raggiunto il 90%-100% di confluenza. 4. Applicazione del flusso continuo alle cellule endoteliali – Aorta-on-a-chip Preparare materiali e reagenti.Preparare il terreno Mix 4 SFM-34 integrando 18 mL di terreno SFM-34 con le citochine Mix 4 secondo la Tabella 2 e inserirlo in una provetta da 50 mL nell’incubatore con il coperchio leggermente svitato per facilitare lo scambio gassoso. Posizionare i set di perfusione selezionati e gli eventuali tubi da utilizzare per la configurazione fluidica nell’incubatore per degasare. Assemblaggio del sistema fluidicoInstallare il set di perfusione nell’unità secondo il protocollo del produttore.NOTA: Ricordarsi di utilizzare clamps nel sistema. Se si utilizzano morsetti scorrevoli per questo passaggio, è necessario farli scorrere sul tubo prima di collegarli al chip. Collegare un nuovo chip fluidico e aggiungere il terreno SFM-34 integrato con citochine, assicurandosi di riempire entrambi i serbatoi in condizioni sterili nella cappa. Eseguire il programma di rimozione delle bolle e la fase di calibrazione. Rimuovere dall’incubatrice l’unità fluidica con il set collegato e trasferirla nella cappa; Prendi anche i chip contenenti le cellule dall’incubatrice. Clamp il tubo su entrambi i lati del chip di prova. Rimuovere il tubo dal chip di prova.NOTA: Verificare che non siano presenti bolle nel connettore Luer all’estremità del tubo. Se sono visibili bolle, aspirarle con cautela utilizzando una pipetta P200 e, se necessario, aggiungere altro terreno per assicurarsi che il connettore sia pieno di fluido. Collegare il chip contenente le celle con il tubo. Rimuovere o aprire i morsetti. Trasferire il sistema nell’incubatrice e collegare la pompa dell’aria all’unità fluidica. Avviare il programma preselezionato utilizzando il software dedicato alla pompa (Figura supplementare S2) con l’aumento graduale della sollecitazione di taglio descritta nella Tabella 3.NOTA: A seconda dell’esperimento specifico necessario, potrebbe essere necessario ottimizzare il programma di stimolazione. Qui viene descritto un graduale aumento dello sforzo di taglio che porta al valore finale di 5 dyn/cm2, che imita lo sforzo di taglio calcolato per essere sperimentato dalla parete dell’aorta dorsale all’inizio della circolazione fetale 9. Indipendentemente dallo sforzo di taglio finale che verrà impiegato, è necessario aumentare gradualmente nel tempo per consentire alle celle di adattarsi alla forza senza causare il distacco delle celle dal chip. Se il protocollo di stimolazione selezionato è più lungo di 3 giorni, le citochine devono essere rabboccate nel sistema aggiungendo 1 mL di SFM-34 contenente le citochine Mix 4 che normalmente verrebbero aggiunte in 18 mL. A tale scopo, il programma della pompa viene rapidamente messo in pausa e vengono aggiunti 500 μL di terreno integrato a ciascuna delle due siringhe del set fluidico. Raccolta di cellule per l’analisiPreriscaldare il tampone di dissociazione a bagnomaria. Rimuovere l’unità fluidica dall’incubatrice e spostarla nella cappa. Clamp il tubo che fiancheggia il chip su entrambi i lati e rimuovere il tubo dai serbatoi sul chip. Rimuovere delicatamente il terreno dal chip e sostituirlo con DPBS Ca 2+ Mg2+ per lavare le cellule.NOTA: Questa fase del lavaggio con PBS può essere saltata se le celle iniziano a staccarsi. Aggiungere delicatamente 150 μL di tampone di dissociazione e incubare per 3 minuti a 37 °C.NOTA: Controllare al microscopio se le cellule sono singole e staccate; in caso contrario, incubare per altri 2 minuti. È essenziale che le cellule siano completamente staccate dal canale prima di aspirare il terreno, in quanto il chip non consente di favorire il distacco cellulare mediante pipettaggio. Altre soluzioni possono essere impiegate per staccare le cellule, come i tamponi a base di tripsina o EDTA. Raccogliere il tampone di dissociazione contenente le cellule da un serbatoio e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 ml e lavare il canale una volta con DPBS per raccogliere tutte le cellule staccate. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio alla provetta da 15 mL con le cellule e prendere 10 μL per contare le cellule. Dividere la sospensione cellulare in provette per citometria a flusso per avere 105 cellule per provetta. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 300 × g. Preparare la soluzione colorante in modo che abbia 50 μL per ogni provetta da colorare. Aggiungere il CD34 PerCP-efluor710 o il CD34-PE rispettivamente a una diluizione di 1:100 e 1:200. Risospendere le cellule in 50 μL di soluzione colorante e incubare per 30 minuti a 4 °C. Lavare le celle aggiungendo 2 ml di tampone di lavaggio e centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Risospendere i pellet in 100 μL di soluzione colorante e acquisire i dati utilizzando un citometro a flusso.NOTA: Le cellule possono anche essere lisate direttamente nel chip per l’estrazione dell’RNA utilizzando 150 μL di tampone di lisi dell’RNA o fissate per l’imaging utilizzando paraformaldeide al 4% in DPBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Analisi dell’orientamento delle celleAnalizzare le immagini per quantificare i cambiamenti nell’orientamento delle celle utilizzando FIJI23 (Figura supplementare S3).Aprire il gestore dell’area di interesse (ROI) dalla finestra di dialogo Analizza | Strumenti | Menu Gestione ROI. Disegna manualmente i contorni delle celle utilizzando lo strumento di selezione dei poligoni e aggiungili a Gestione ROI facendo clic su Aggiungi o utilizzando la scorciatoia CTRL+T . Misurare l’orientamento di ogni ROI scegliendo la misura Adatta ellisse nella finestra di dialogo Analizza | Menu Imposta misure . Applica la misurazione a tutti i ROI attraverso il Altro… Comando Misura multipla in Gestione ROI.NOTA: questo passaggio adatterà un’ellisse a ciascuna ROI e genererà una tabella contenente la lunghezza degli assi dell’ellisse maggiore e minore, nonché l’angolo. Esporta la tabella in un file CSV da importare in un altro software per stampare.NOTA: Lo script utilizzato per i grafici è disponibile all’indirizzo https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ddc.